Remove ads
Inhibitor enzima je molekul koji se vezuje za enzim i umanjuje njegovu aktivnost. Pošto blokiranje enzimske aktivnosti može da uzrokuje uginuće patogena ili da koriguje metaboličku neuravnoteženost, stoga su mnogi lekovi inhibitori enzima. Inhibitori enzima se takođe koriste kao pesticidi. Nisu svi molekuli koji se vezuju za enzime inhibitori; aktivatori enzima se vezuju za enzime i povećavaju njihovu aktivnost, dok se enzimski supstrati vezuju i bivaju konvertovani do produkata u normalnom katalitičkom ciklusu enzima.
Vezivanje inhibitora može da spreči pristup supstrata enzimskom aktivnom mestu i/ili omete enzim pri katalizi biohemijske reakcije. Vezivanje inhibitora može da bude reverzibilno ili ireverzibilno. Ireverzibilni inhibitori obično reaguju sa enzimom i hemijski ga menjaju (npr. formiranjem kovalentne veze), te modifikuju ključne aminokiselinske ostatke neophodne za enzimatsku aktivnost. Nasuprot ovome, reverzibilni inhibitori se vezuju nekovalentno, te se različiti tipovi inhibicije javljaju zavisno od toga da li se inhibitori vezuju za enzim, za enzimsko-supstratni kompleks, ili za oboje.[1]
Mnogi molekuli lekova su inhibitori enzima, tako da je njihovo otkrivanje i poboljšanje aktivna oblast istraživanja u biohemiji i farmakologiji. Medicinski enzimski inhibitori se često vrednuju po svojoj specifičnosti (svom odsustvu vezivanja za druge proteine) i svojoj potentnosti (svojoj konstanti disocijacije, koja je indikator koncentracije neophodne za inhibiciju enzima). Visoka specifičnost i potentnost su preduslovi da lek ispoljava mali broj nuspojava i stoga nisku toksičnost.
Enzimski inhibitori se isto tako javljaju u prirodi i učestvuju u regulaciji metabolizma. Na primer, enzimi u metaboličkom putu mogu da budu inhibirani produktima daljih koraka puta. Ovaj tip povratne sprege usporava ćelijsku proizvodnu liniju kad produkti počnu da se nakupljaju, i to je jedan od važnih načina održavanja homeostaze u ćelijama. Drugi ćelijski enzimski inhibitori su proteini, koji se specifično vezuju za i inhibiraju enzimsku metu. To može da pomogne u kontroli enzima, koji bi inače mogli da oštete ćeliju, kao što su proteaze ili nukleaze. Jedna detaljno okarakterisana klasa inhibitornih molekula su ribonukleazni inhibitori, koji se vezuju za ribonukleaze formirajući jednu od najčvršćih poznatih protein—protein interakcija.[2] Prirodni enzimski inhibitori takođe mogu da budu otrovi i da se koriste kao vid odbrane od predatora, ili kao način ubijanja plena.
Remove ads
Tipovi reverzibilnih inhibitora
Reverzibilni inhibitori se vezuju za enzime putem nekovalentnih interakcija kao što su vodonične veze, hidrofobne interakcije i jonske veze. Višestruke slabe veze između inhibitora i aktivnog mesta se kombinuju i proizvode jako i specifično vezivanje. Za razliku od supstrata i ireverzibilnih inhibitora, reverzibilni inhibitori generalno ne podležu hemijskim reakcijama pri vezivanju za enzim i mogu lako da se uklone razblaživanjem ili dijalizom.
Postoje četiri vrste reverzibilnih enzimskih inhibitora. Klasifikuju se na osnovu uticaja promenljive koncentracije enzimskog supstrata na inhibitor.[3]
- U konkurentnoj inhibiciji, supstrat i inhibitor ne mogu istovremeno da se vežu za enzim, kao što je to prikazano na slici desno. To je obično posledica toga da inhibitor ima afinitet za aktivno mesto enzima za koje se takođe vezuje supstrat; supstrat i inhibitor se nadmeću za pristup aktivnom mestu enzima. Ovaj tip inhibicije se može prevazići primenom dovoljno visokih koncentracija supstrata ( ostaje konstantno), od. putem nadmašivanja koncentracije inhibitora. Međutim, dolazi do povećanja pojavne vrednosti , jer je potrebna veća koncentracija supstrata da bi se dosegla tačka , ili polovina vrednosti .[4] Konkurentni inhibitori su obično strukturno slični realnom supstratu (vidi primere ispod).
- U nekonkurentnoj inhibiciji, inhibitor se jedino vezuje za supstratno-enzimski kompleks. Ovaj tip inhibicije uzrokuje sniženje vrednosti (maksimalna brzina se smanjuje usled uklanjanja aktiviranog kompleksa) i vrednosti (usled povećane efikasnosti vezivanja koja proizilazi iz Le Šateljeovog principa i efektivne eliminacije kompleksa čime se umanjuje , što je indikator povećanog afiniteta vezivanja).[4]
- U beskonkurentnoj inhibiciji, vezivanjem inhibitora za enzim redukuje se njegova aktivnost, mada to nema uticaja na vezivanje supstrata. Rezultat ovoga je da stepen inhibicije jedino zavisi od koncentracije inhibitora. Vrednost se smanjuje, jer se reakcija odvija manje efikasno, dok se vrednost ne menja, pošto se samo vezivanje supstrata — po definiciji — i dalje normalno odvija.[4]
- U mešovitoj inhibiciji, inhibitor se može vezati za enzim istovremeno sa supstratom enzima. Međutim, ovakvo vezivanje inhibitora utiče na vezivanje supstrata, i obrnuto. Ova vrsta inhibicije se može umanjiti, ali ne i prevazići povećanjem koncentracije supstrata. Mada postoji mogućnost da se inhibitori mešovitog tipa vežu na aktivnom mestu, ovaj tip inhibicije generalno proizilazi iz alosternog dejstva, pri čemu se inhibitor vezuje na različitom mestu na enzimu. Vezivanje inhibitora za alosterno mesto menja konformaciju (tj. tercijarnu strukturu ili trodimenzionalni oblik) enzima, tako da je afinitet supstrata za aktivno mesto umanjen.[4]
Kvantitativni opis reverzibilne inhibicije
Reverzibilna inhibicija se može kvantitativno opisati u pogledu vezivanja inhibitora za enzim i za enzimsko-supstratni kompleks, kao i njegovog uticaja na kinetičke konstante enzima. U klasičnoj Mihaelis—Menteninoj šemi ispod, enzim () vezuje se za svoj supstrat () i formira enzimsko-supstratni kompleks . Nakon katalize, ovaj kompleks se razlaže i oslobađaju se produkt i slobodni enzim. Inhibitor () može se vezati ili za ili za sa konstantama disocijacije ili ′, redom.
|
 |
Kada enzim ima višestruke supstrate, inhibitori mogu da ispolje različite tipove inhibicije u zavisnosti od toga koji se supstrat posmatra. Do ovoga dolazi zato što aktivno mesto sadrži dva različita mesta vezivanja, po jedno za svaki supstrat. Na primer, inhibitor se može nadmetati sa supstratom za prvo mesto vezivanja, a biti beskonkurentni inhibitor supstrata u drugom mestu vezivanja.[5]
Merenje konstanti disocijacije reverzibilnog inhibitora
Kao što je napomenuto iznad, enzimski inhibitor se opisuje putem svojih dveju konstanti disocijacije: i ′, za enzim i enzimsko-supstratni kompleksa, redom. Enzimsko-inhibitorska konstanta se može direktno meriti različitim metodima. Jedan od izuzetno preciznih metoda je izotermalna titraciona kalorimetrija, u kojoj se inhibitor titrira u rastvor enzima; potom se meri oslobođena ili apsorbovana toplota.[6] Međutim, drugu konstantu disocijacije ′ je teško direktno meriti, pošto je enzimsko-supstratni kompleks kratkotrajan i podleže hemijskoj reakciji kojom se formira produkt. Stoga se ′ obično indirektno meri, i to putem posmatranja enzimske aktivnosti pri različitim koncentracijama supstrata i inhibitora, te postavljanjem podataka[7] u modifikovanu Mihaelis—Menteninu jednačinu.
![{\displaystyle V={\frac {V_{max}[S]}{\alpha K_{m}+\alpha ^{\prime }[S]}}={\frac {(1/\alpha ^{\prime })V_{max}[S]}{(\alpha /\alpha ^{\prime })K_{m}+[S]}}}](http://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/4a8f0a9dda1d308de7f090f99c2833f944f11a09)
gde su modifikujući faktori α i α′ definisani putem koncentracije inhibitora i njegovih dveju konstanti disocijacije:
![{\displaystyle \alpha =1+{\frac {[I]}{K_{i}}}}](http://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/57fcf54938a9784f9313437681b220079ff43ee5)
![{\displaystyle \alpha ^{\prime }=1+{\frac {[I]}{K_{i}^{\prime }}}}](http://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/8b7d75a61e059ecea4053a1c7afb91f9cf39a2ab)
Stoga, u prisustvu inhibitora, enzimske efektivne vrednosti i postaju (α/α′) i (1/α′)max, redom. Treba imati u vidu da modifikovana Mihaelis—Mentenina jednačina podrazumeva da je ostvarena ravnoteža vezivanja inhibitora za enzim, što može da bude veoma spor proces za inhibitore sa podnanomolarnim konstantama disocijacije. U tim slučajevima, obično je praktičnije da se tretira čvrsto vezujući inhibitor kao ireverzibilni inhibitor (vidi ispod); mada, još uvek može da postoji opcija kinetičkog procenjivanja ′, ako se nezavisno izmeri .
Uticaji različitih tipova reverzibilnih inhibitora enzima na enzimatsku aktivnost se mogu prikazati koristeći grafičke reprezentacije Mihaelis—Mentenine jednačine, kao što su Lajnviver—Berkov i Edi—Hofstijev dijagram. Na primer, na Lajnviver—Berkovom dijagramu prikazanom desno, linije konkurentne inhibicije seku se na -osi, što ilustruje da takvi inhibitori nemaju uticaja na . Analogno, linije beskonkurentne inhibicije seku se na -osi, što pokazuje da ovi inhibitori ne utiču na . Međutim, često je teško precizno proceniti i ′ sa dijagrama,[8] pa se preporučuje korišćenje pouzdanijih metoda nelinearne regresije za procenu konstanti (opisano iznad).
Reverzibilni inhibitori
Tradicionalno se reverzibilni inhibitori enzima klasifikuju kao konkurentni, nekonkurentni ili beskonkurentni, na osnovu njihovog uticaja na parametre i . Ti različiti uticaji direktno proizilaze iz načina vezivanja inhibitora za enzim , enzimsko-supstratni kompleks , ili oba. Podela u ove klase proističe iz problema sa određivanjem parametara i stvara potrebu za korišćenjem različitih konstanti vezivanja za opisivanje čina vezivanja. Vezivanje inhibitora i njegov uticaj na enzimatsku aktivnost su dve potpuno različite svari, što je još jedan problem koji tradicionalne jednačine ne odražavaju. Kod nekonkurentne inhibicije vezivanje inhibitora sledstveno jednačinama jedino dovodi do potpune (100%) inhibicije enzima, i jednačine ne ostavljaju mogućnost postojanja bilo čega između tih krajnosti.[9] Zajednički oblik inhibitornog člana takođe zamagljuje odnos između vezivanja inhibitora za enzim i njegovog odnosa sa drugim članovima vezivanja, bilo da je to Mihaelis—Mentenina jednačina ili dozno-responsna kriva asocirana sa vezivanjem liganda za receptor. Da bi se demonstrirao odnos, može se stvoriti sledeće preraspoređivanje:
![{\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{1+{\cfrac {\ce {[I]}}{K_{i}}}}}={\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[{\ce {I}}]+K_{i}}{K_{i}}}}}](http://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/974bf2132f8729fe17e42bcf5e6835fd9bf541fc)
Dodajući nulu na dno ([]−[]):
![{\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[{\ce {I}}]+K_{i}}{[{\ce {I}}]+K_{i}-[{\ce {I}}]}}}}](http://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/ea1e5957a1680cbbd38b9a6157e59859632c37ba)
... i deleći sa []+ dobija se:
![{\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {1}{1-{\cfrac {\ce {[I]}}{[{\ce {I}}]+K_{i}}}}}}=V_{\max }-V_{\max }{\cfrac {\ce {[I]}}{[{\ce {I}}]+K_{i}}}}](http://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/1dd17bc78dc831a088b059c70ea9b734c99f15a5)
Ova jednačina demonstrira da je slično Mihaelis—Menteninoj jednačini, gde brzina reakcije zavisi od procenta enzimske populacije koja međudeluje sa supstratom:
razlomak enzimske populacije vezane supstratom
![{\displaystyle {\cfrac {\ce {[S]}}{[{\ce {S}}]+K_{m}}}}](http://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/eb08dd139085a394e6e7370f47ebfa255f1ad685)
razlomak enzimske populacije vezane inhibitorom
![{\displaystyle {\cfrac {\ce {[I]}}{[{\ce {I}}]+K_{i}}}}](http://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/9ed50a1f7a5f2c52f406b52263916ab48b268e07)
... uticaj inhibitora rezultat procenta populacije enzima koja međudeluje sa inhibitorom. Jedini problem sa ovom jednačinom u njenoj trenutnoj formi je što podrazumeva apsolutnu inhibiciju enzima vezivanjem inhibitora, dok se u stvarnosti može javiti širok opseg uticaja: od 100% inhibicije supstrata do samo izvesnog procenta, > 0%. Da bi se ovo uzelo u obzir, jednačina se može jednostavno modifikovati uvođenjem člana delta V, tako da dozvoljava različite stepene inhibicije:
![{\displaystyle V_{\max }-\Delta V_{\max }{\cfrac {\ce {[I]}}{[{\ce {I}}]+K_{i}}}}](http://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/7dff424ec79284c3a1cea14f0f82b0eaace53c69)
... ili:
![{\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {\ce {[I]}}{[{\ce {I}}]+K_{i}}}}](http://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/f3874623edd9524ba2741fe448927bf5cf0ab257)
Ovaj član može onda da definiše rezidualni procenat enzimatske aktivnosti kad inhibitor interaguje sa individualnim enzimima u populaciji. Uvrštavanje ovog člana ima dodatnu prednost dozvoljavanja mogućnosti aktivacije ako se ispostavi da je sekundarni član veći od inicijalnog člana. Da bi se u obzir takođe uzela mogućnost aktivacije, jednačina se može prilagoditi zamenjivanjem inhibitorske oznake „” opštom oznakom odnosno modifikatorskim članom koji je ovde označen sa „”:
![{\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {\ce {[X]}}{[{\ce {X}}]+K_{x}}}}](http://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/306d44733a89308883053e3b8372a8cf9ce0239b)
Dok ova terminologija dovodi do pojednostavljenog načina rukovanja kinetičkim efektima vezanim za maksimalnu brzinu Mihaelis—Mentenine jednačine, ona isto tako naglašava potencijalne probleme sa članovima koji se koriste za opisivanje efekata vezanih za . Vrednost vezana za afinitet enzima za supstrat je u većini slučaja povezana sa mogućim promenama mesta vezivanja enzima, što je direktna posledica interakcije enzima i inhibitora. Stoga je član sličan gorenavedenom članu za korekciju podesan u većini slučajeva:[10][11]
![{\displaystyle K_{m1}-(K_{m1}-K_{m2}){\cfrac {\ce {[X]}}{[{\ce {X}}]+K_{x}}}}](http://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/cb4e0de216e1e625bb803ee725bf85c9989a15f5)
Specijalni slučajevi
- Mehanizam parcijalno konkurentne inhibicije je sličan onom beskonkurentne, izuzev što kompleks ima katalitičku aktivnost, koja može da bude niža ili čak viša (parcijalno kompetitivna aktivacija) od aktivnosti enzimsko-supstratnog () kompleksa. Ova inhibicija tipično ispoljava nižu vrednost , dok se vrednost ne menja.[5][12]
- Nekonkurentna inhibicija se javlja kada se inhibitor vezuje samo za enzimsko-supstratni kompleks, ne i za slobodni enzim; kompleks je katalitički neaktivan. Ovaj način inhibicije je redak i uzrokuje smanjivanje obeju vrednosti, i i .[5]
- Inhibicija supstrata i produkata se javlja kad bilo supstrat ili produkt enzimatske reakcije inhibira enzimsku aktivnost. Ovaj oblik inhibicije može da sledi kompetitivne, nekompetitivne ili mešovite obrasce. Pri supstratnoj inhibiciji dolazi do progresivnog smanjenja aktivnosti pri visokim koncentracijama supstrata. To može da bude indikacija postojanja dva mesta vezivanja supstrata na enzimu. Pri niskim koncentracijama supstrata, mesto visokog afiniteta je okupirano i normalna kinetika dolazi do izražaja. Međutim, pri višim koncentracijama dolazi do zauzeća sekundarnog, inhibitornog mesta, čime se inhibira enzim.[13] Produkt inhibicije često služi kao regulatorno svojstvo pri metabolizmu i može da formira negativnu povratnu spregu.[14]
- Spora nepropusna inhibicija se javlja kad inicijalni kompleks enzima i inhibitora () podleže izomerizaciji do drugog, čvršće pakovanog (nepropusnog) kompleksa, *, iako je sveukupni proces inhibicije reverzibilan.[15] Ovo se manifestuje kao sporo rastuća inhibicija enzima. Pod ovim uslovima, tradicionalna Mihaelis—Mentenina kinetika daje pogrešnu vrednost za , jer je ona zavisna od vremena. Tačna vrednost se može dobiti putem kompleksnije analize konstanti brzina asocijacije () i disocijacije () inhibitora. Dodatne informacije su dostupne u odeljku o ireverzibilnoj inhibiciji.
Primeri reverzibilnih inhibitora
Enzimi su evoluciono razvili sposobnost čvrstog vezivanja svojih supstrata; kako se većina reverzibilnih inhibitora vezuje za aktivno mesto enzima, nije iznenađujuće da neki od tih inhibitora imaju veoma slične strukture sa supstratima svoje mete. Jedan od primera oponašanja supstrata su proteazni inhibitori. Oni su veoma uspešna klasa antiretroviralnih lekova koji se koriste za lečenje infekcije HIV.[16] Struktura ritonavira, proteaznog inhibitora koji je baziran na peptidu i koji sadrži tri peptidne veze, prikazana je sa desne strane. Ovaj lek nalikuje na protein koji je supstrat HIV proteaze; nadmeće sa ovim supstratom za pristup aktivnom mestu enzima.
Enzimski inhibitori se često dizajniraju tako da oponašaju prelazno stanje ili intermedijer enzimski katalizovane reakcije. Time se osigurava da inhibitor iskoristi stabilizujući efekat prelaznog stanja enzima, što dovodi do poboljšanog afiniteta vezivanja (niže vrednosti) nego što je to slučaj sa dizajnima zasnovanim na supstratu. Primer ovakvog inhibitora prelaznog stanja je antiviralni lek oseltamivir; ovaj lek oponaša planarnu strukturu prstena oksonijumskog jona u reakciji viralnog enzima neuraminidaze.[17]
Međutim, nisu svi inhibitori bazirani na strukturama supstrata. Na primer, struktura drugog inhibitora HIV proteaze tipranavira prikazana je na levoj strani. Ovaj molekul nije zasnovan na peptidu i nije očiglednu strukturnu sličnost sa proteinskim supstratom. Ovi nepeptidni inhibitori mogu da budu stabilniji od inhibitora koji sadrže peptidne veze, pošto oni ne mogu da budu supstrati peptidaza i mnogo manje su skloni degradaciji.[18]
Pri dizajnu lekova je važno da se uzmu u obzir koncentracije supstrata kojima su izloženi ciljni enzimi. Na primer, neki inhibitori proteinskih kinaza imaju hemijske strukture koje su slične adenozin-trifosfatu, jednom od supstrata pomenutih enzima. Međutim, lekovi koji su jednostavni kompetitivni inhibitori će morati da se nadmeću sa visokim koncentracijama ATP molekula u ćeliji. Proteinske kinaze se isto tako mogu inhibirati konkurisanjem za mesta vezivanja na kojima kinaze međudeluju sa svojim supstratnim proteinima, a većina proteina je prisutna u ćelijama sa daleko nižim koncentracijama od koncentracije ATP molekula. Posledično, ako se dva inhibitora proteinske kinaze vezuju za aktivna mesta sa sličnim afinitetom — a samo jedan od njih treba da se nadmeće sa ATP molekulima, onda će kompetitivni inhibitor na mestu proteinskog vezivanja efektivnije inhibirati enzim.[19]
Remove ads
Tipovi ireverzibilne inhibicije (kovalentna inaktivacija)
Ireverzibilni inhibitori obično kovalentno modifikuju enzim, te inhibicija stoga ne može da bude povratna. Ireverzibilni inhibitori često sadrže reaktivne funkcionalne grupe, kao što su azotni iperiti, aldehidi, haloalkani, alkeni, Majklovi akceptori, fenil sulfonati ili fluorofosfonati. Te elektrofilne grupe reaguju sa aminokiselinskim bočnim lancima i formiraju kovalentne dodatke. Modifikovani ostaci su oni sa bočnim lancima koji sadrže nukleofile kao što su hidroksilne ili sulfhidrilne grupe; tu se ubrajaju aminokiseline serin (npr. molekuli, prikazano na desnoj strani), cistein, treonin ili tirozin.[20]
Ireverzibilna inhibicija se razlikuje od ireverzibilne enzimske inaktivacije. Ireverzibilni inhibitori su generalno specifični za jednu klasu enzima i ne inaktiviraju sve proteine; ne funkcionišu uništavajući proteinske strukture nego specifičnim izmenjivanjem aktivnog mesta svoje mete. Na primer, ekstremi vrednosti ili temperature obično uzrokuju denaturaciju svih proteinskih struktura, što je nespecifičan efekat. Pojedini nespecifični hemijski tretmani analogno uništavaju proteinsku strukturu: na primer, zagrevanje u koncentrovanoj hlorovodoničnoj kiselini će hidrolizovati peptidne veze koje proteine drže na okupu, oslobađajući ovime slobodne aminokiseline.[21]
Ireverzibilni inhibitori ispoljavaju vremenski zavisnu inhibiciju i njihova potentnost se stoga ne može okarakterisati pomoću 50 vrednosti. Razlog za ovo je što se količina aktivnog enzima pri datoj koncentraciji ireverzibilnog inhibitora razlikuje u zavisnosti od toga koliko dugo je inhibitor bio preinkubiran sa enzimom. Zbog ovoga, umesto 50 koriste se /[] vrednosti,[22] gde je uočena brzina inaktivacije pseudoprvog reda (izvedena is grafika zavisnosti logaritamske vrednosti postotne aktivnosti od vremena) a [] koncentracija inhibitora. Parameter /[] je validan dokle god se inhibitor ne zasiti vezivanjem za enzim (u kom slučaju je = ).
Analiza ireverzibilne inhibicije
Kao što je prikazano na šemi levo, ireverzibilni inhibitori formiraju reverzibilni nekovalentni kompleks sa enzimom ( ili ), i zatim dolazi do reakcije kojom se formira kovalentno modifikovani neaktivni kompleks *. Brzina kojom se * formira se naziva brzinom inaktivacije, ili . Pošto formiranje EI može da se nadmeće sa , vezivanje ireverzibilnih inhibitora se može sprečiti konkurencijom bilo sa supstratom ili sa drugim, reverzibilnim inhibitorom. Ovaj protekcioni efekat je dobra potvrda specifičnosti reakcije ireverzibilnog inhibitora sa aktivnim mestom.
Koraci vezivanja i inaktivacije ove reakcije se ispituju putem inkubacije enzima sa inhibitorom i utvrđivanjem stepena aktivnosti koja preostaje tokom vremena. Aktivnost će opadati na vremenski zavisan način, obično sledeći eksponencijalni raspad. Uklapanjem ovih podataka u jednačinu brzine dobija se brzina inaktivacije pri datoj koncentraciji inhibitora. Ovo se radi za nekoliko različitih koncentracija inhibitora. Ako dolazi do formiranja reverzibilnog kompleksa, biće uočljivo zasićenje brzine inaktivacije i iz odgovarajuće krive biće moguće izvesti i .[23]
Drugi metod koji je u širokoj upotrebi u ovim analizama je masena spektrometrija. Ovde precizno merenje mase nemodifikovanog prirodnog enzima i inaktiviranog enzima daje povećanje mase uzrokovano reakcijom sa inhibitorom i pokazuje stehiometriju reakcije.[24] To se obično radi koristeći maseni spektrometar. U komplementarnoj tehnici zvanoj peptidni maseni otisci prstiju vrši se razlaganje prirodnog i modifikovanog proteina dejstvom proteaze, kao što je tripsin. Time nastaje set peptida koji se mogu analizirati koristeći maseni spektrometar. Peptidi koji promene masu nakon reakcije sa inhibitorom su oni koji sadrže mesto modifikacije.
Specijalni slučajevi
Ne formiraju svi ireverzibilni inhibitori kovalentne dodatke na svojim enzimskim metama. Neki reverzibilni inhibitori se tako čvrsto vežu za svoje ciljne enzime da su u suštini ireverzibilni. Ovi potentno vezujući inhibitori mogu da ispolje kinetiku sličnu kovalentnim ireverzibilnim inhibitorima. Neki od ovih inhibitora se brzo vezuju za enzim u kompleksu niskog afiniteta i zatim dolazi do sporog preraspoređivanja do veoma čvrsto vezanog * kompleksa (pogledajte levu sliku iznad). Ovakvo kinetičko ponašanje se naziva sporim vezivanjem.[26] Spori rearanžman nakon vezivanja često obuhvata konformacionu promenu pri čemu se enzim obavije oko molekula inhibitora. Primeri sporo vezujućih inhibitora su neki važni lekovi, kao što je metotreksat,[27] alopurinol[28] i aktivirani oblik aciklovira.[29]
Primeri ireverzibilnih inhibitora
Diizopropilfluorofosfat () prikazan je kao primer ireverzibilnog proteaznog inhibitora na desnoj slici iznad. Enzim hidrolizuje fosforno-fluornu vezu, ali fosfatni ostatak ostaje vezan za serin u aktivnom mestu, čime se enzim deaktivira.[30] Slično ovome, takođe reaguje sa aktivnim mestom acetilholinske esteraze u sinapsama neurona; posledično je potentan neurotoksin, sa smrtnom dozom manjom od 100 .[31]
Samoubilačka inhibicija je neobični tip ireverzibilne inhibicije gde enzim konvertuje inhibitor u reaktivnu formu u svom aktivnom mestu. Primer takvog jedinjenja je inhibitor poliaminske biosinteze, α-difluorometilornitin ili , koji je analogan aminokiselini ornitin i koristi se za lečenje afričke tripanosomijaze (bolest spavanja). Ornitinska dekarboksilaza može da katalizuje dekarboksilaciju umesto ornitina, kao što je prikazano iznad. Međutim, ovoj reakciji dekarboksilacije sledi eliminacija atoma fluora, čime se ovaj katalitički intermedijer konvertuje u konjugovani imin, koji je veoma elektrofilno jedinjenje. Ova reaktivna forma molekula zatim reaguje ili sa cisteinom ili sa lizinom u aktivnom mestu, da bi se enzim ireverzibilno inaktivirao.[25]
Pošto ireverzibilna obično obuhvata prvobitno formiranje nekovalentnog kompleksa, ponekad je moguće da se inhibitor veže za enzim na više od jednog načina. Na primer, na slici levo na kojoj je prikazana tripanotionska reduktaza iz ljudskog protozoanskog parazita , dva molekula inhibitora zvanog kvinakrinski iperit vezana su u aktivnom mestu ovog enzima. Gornji molekul je reverzibilno vezan, dok je donji vezan kovalentno pošto je reagovao sa aminokiselinskim ostatkom putem azotnoiperitne grupe.[32]
Remove ads
Novi lekovi su produkti dugotrajnog procesa razvoja lekova. Prvi korak u tom procesu je često otkriće novog enzimskog inhibitora. U prošlosti je jedini način da se otkriju novi inhibitori bio pristup pokušaja i greške: testiranje ogromnih kolekcija jedinjenja na ciljnom enzimu u nadi da će se doći korisnih molekula. Ovaj pristup grube sile je još uvek uspešan i bio je unapređen primenom pristupa kombinatorne hemije kojima se omogućava brza proizvodnja ogromnog broja novih jedinjenja, kao i tehnologijom visokopropusnog skrininga da bi se brzo testirale ogromne hemijske kolekcije (biblioteke) s ciljem nalaženja inhibitora.[33]
Jedan od skorašnjih alternativnih pristupa je racionalni dizajn lekova, pri čemu se koristi trodimenzionalna struktura aktivnog mesta enzima da bi se predvidelo koji molekuli bi mogli da budu inhibitori.[34] Ta predviđanja se zatim testiraju. Novi inhibitori se nakon toga koriste za dobijanje strukture enzima u kompleksu inhibitor/enzim, da bi se potvrdilo na koji način su molekuli vezani za aktivno mesto. Na bazi struktura je moguće dizajnirati izmenjene inhibitore s ciljem dalje optimizacije vezivanja. Ovaj ciklus testiranja i poboljšanja se zatim ponavlja dok se ne dođe do dovoljno potentnih inhibitora.[35] Niz pristupa baziranih na primeni računara za predviđanje afiniteta inhibitora za enzim takođe je u razvoju. Primeri ovakvih metoda su molekularni doking[36] i molekulska mehanika.[37][38]
Remove ads
Enzimski inhibitori se mogu naći u prirodi. Osim njih postoji i znatan broj inhibitora koji su dizajnirani i proizvode se za farmakološke svrhe i biohemijska istraživanja. Prirodni otrovi su često enzimski inhibitori koji su evoluirali da štite biljke ili životinje od predatora. Ti prirodni toksini obuhvataju neke od najsmrtonosnijih otrova. Veštački inhibitori se često koriste kao lekovi, mada isto tako mogu da budu i insekticidi kao što je malation, herbicidi kao što je glifosat, ili dezinfektanti kao što je triklosan. Deo veštačkih enzimskih inhibitora blokira acetilholinesterazu, enzim koji razlaže acetilholin; koriste se kao nervni agensi u bojnim otrovima.
Hemioterapija
 |
 |
 |
Enzimski inhibitori se najčešće koriste kao lekovi za tretman bolesti. Mnogi od njih deluju na ljudske enzime s ciljem korigovanja patološkog stanja. Međutim, nisu svi lekovi enzimski inhibitori. Neki, kao što su antiepileptički lekovi, menjaju aktivnost enzima uzrokujući da se enzim proizvodi u manjoj ili većoj količini. Ovi efekti se nazivaju enzimska indukcija i inhibicija[42] i predstavljaju promene u izražavanju gena. To nije direkno povezano sa tipom enzimske inhibicije o kojem se ovde govori. Drugi lekovi međudeluju sa ćelijskim metama koje nisu enzimi, kao što su jonski kanali ili membranski receptori.
Primer medicinskog enzimskog inhibitora je sildenafil (vijagra), popularni lek za mušku erektilnu disfunkciju. Ovo jedinjenje je potentni inhibitor specifične fosfodiesteraze tipa 5, enzima koji degradira signalni molekul ciklični guanozin monofosfat.[43] Ovaj signalni molekul podstiče relaksaciju glatkih mišića i omogućava protok krvi u , što uzrokuje erekciju. Pošto lek umanjuje aktivnost enzima koji zaustavlja signal, produžava se trajanje signala.
Još jedan primer strukturne sličnosti pojedinih inhibitora sa supstratima enzima na koje deluju je prikazan na slici desno na kojoj se poredi lek metotreksat sa folnom kiselinom (vitamin B9). Folna kiselina je supstrat dihidrofolatne reduktaze, enzima koji učestvuje u formiranju nukleotida i koji biva potentno inhibiran metotreksatom. Metotreksat blokira dejstvo dihidrofolatne reduktaze i time zaustavlja produkciju nukleotida. Ova blokada nukleotidne biosinteze je toksičnija za brzorastuće ćelije nego za one koje se ne dele, zato što brzorastuće ćelije moraju da izvode replikaciju DNK. Stoga se metotreksat obično koristi za hemoterapiju kancera.[44]
Antibiotici
Lekovi se isto tako koriste za inhibiranje enzima neophodnih za opstanak patogena.[45][46] Na primer, bakterije su okružene debelim ćelijskim zidom sačinjenim iz polimera koji nalikuje na mrežu i zove se peptidoglikan. Mnogi antibiotici, kao što su penicilin i vankomicin, inhibiraju enzime koji proizvode i potom umrežavaju niti tog polimera.[47] Posledica njihovog dejstva je da bakterijski ćelijski zid gubi jačinu i bakterije se rasprsnu.[48] Na slici, molekul penicilina (prikazan u formi „kugli i štapića”) vezan je za svoj ciljni enzim, transpeptidazu iz bakterije 61 (protein je prikazan kao trakasti dijagram).[49]
Antibiotički dizajn lekova je olakšan kad je enzim koji je esencijalan za opstanak patogena odsutan ili veoma različit kod ljudi.[50] U primeru iznad, ljudsko telo ne pravi peptidoglikan, i stoga su inhibitori tog procesa selektivno toksični za bakterije. Selektivna toksičnost se takođe ostvaruje kod antibiotika kroz iskorišćavanje razlika u strukturi ribozoma kod bakterija,[51] ili načina na koji prave masne kiseline.[52]
Metabolička kontrola
Enzimski inhibitori su važni u metaboličkoj kontroli.[53] Mnogi ćelijski metabolički putevi su inhibirani metabolitima, koji kontrolišu enzimsku aktivnost putem alosterne regulacije ili inhibicije supstrata. Dobar primer je alosterna regulacija glikolitičkog puta.[54] Ovaj katabolički put konzumira glukozu i proizvodi , i piruvat.[55][56] Ključni korak u regulaciji glikolize je jedna rana reakcija puta koja je katalizovana fosfofruktokinazom-1 (1).[57][58] Kad se nivo povisi, se vezuje za alosterno mesto na 1 čime se smanjuje brzina enzimske reakcije; glikoliza se inhibira i opada produkcija . Ovaj oblik kontrole negativnom povratnom spregom pomaže u održavanju stabilnog nivoa koncentracije molekula u ćeliji.[59] Međutim, metabolički putevi se ne regulišu samo inhibicijom, već je aktivacija enzima jednako važna. U odnosu na 1, fruktoza 2,6-bisfosfat i predstavljaju primere metabolita koji deluju kao alosterini aktivatori.[60]
Fiziološka enzimska inhibicija se takođe može proizvesti putem specifičnih proteinskih inhibitora. Ovaj mehanizam se javlja u pankreasu, koji sintetiše mnoštvo digestivnih prekursorskih enzima, poznatih kao zimogeni.[61][62] Mnogi od njih se aktiviraju dejstvom proteaze tripsin,[63] tako da je važno da se inhibira aktivnost tripsina u pankreasu da bi se sprečila mogućnost da organ počne da probavlja sam sebe.[64] Jedan način kontrole aktivnosti tripsina je produkcija specifičnog i potentnog proteinskog inhibitora tripsina u pankreasu.[65] Taj inhibitor se čvrsto vezuje za tripsin, sprečavajući aktivnost tripsina koja bi inače bila štetna za organ.[66] Mada je tripsinski inhibitor protein, on izbegava da postane supstrat proteaze tako što uklanja vodu iz aktivnog mesta tripsina i time destabilizuje prelazno stanje.[67] Drugi primeri fizioloških enzimskih inhibitornih proteina su barstar koji je inhibitor bakterijske ribonukleaze barnaze[68][69][70][71] i inhibitori proteinskih fosfataza.[72]
Pesticidi i herbicidi
Mnogi pesticidi su enzimski inhibitori.[73] Acetilholinesteraza () enzim je koji je prisutan u životinjama od insekata do ljudi.[74][75] Esencijalan je za funkciju nervnih ćelija.[76] Ovaj enzim deluje tako što razlaže neurotransmiter acetilholin u njegove konstituente, acetat i holin.[77][78] Acetilholin je donekle jedinstven među neurotransmiterima u smislu da se većina njih, uključujući serotonin, dopamin, i norepinefrin, apsorbuje iz sinaptičkog otvora umesto da bude razgrađena. Veliki broj inhibitora se koristi u medicini i agrikulturi.[77][78] Reverzibilni konkurentni inhibitori, kao što je edrofonijum,[79] fizostigmin i neostigmin, koriste se za tretman miastenije gravis[80][81][82] i za anesteziju.[83] Karbamatni pesticidi su takođe primeri reverzibilnih inhibitora.[84] Organofosfatni pesticidi kao što su malation, paration i hlorpirifos ireverzibilno inhibiraju acetilholinesterazu.[85]
Herbicid glifosat je inhibitor 3-fosfošikimat 1-karboksiviniltransferaze.[86][87][88] Drugi herbicidi, kao što su sulfonilureje, inhibiraju enzim acetolaktatnu sintazu.[89][90] Oba ova enzima su neophodna da bi biljke pravile aminokiseline sa razgranatim bočnim lancem. Herbicidi inhibiraju mnoge druge enzime, uključujući enzime koji su neophodni za biosintezu lipida[91] i karotenoida,[92] kao i za procese fotosinteze i oksidativne fosforilacije.[93]
Prirodni otrovi
Životinje i biljke su tokom evolucije razvile sposobnost da sintetišu širok opseg otrovnih produkata uključujući sekundarne metabolite,[94] peptide i proteine koji mogu da deluju kao inhibitori. Prirodni toksini su obično mali organski molekuli i toliko su raznovrsni da su verovatno prirodni inhibitori većine metaboličkih procesa.[95][96] Metabolički procesi na koje deluju prirodni otrovi obuhvataju ne samo enzime metaboličkih puteva, nego i inhibiciju receptora, kanala i strukturnih proteinskih funkcija u ćeliji.[97] Na primer, paklitaksel (taksol),[98] organski molekul prisutan u pacifičkoj tisovini, čvrsto se vezuje za tubulinske dimere i inhibira njihovo uklapanje u mikrotubule citoskeletona.[99][100][101]
Mnogi prirodni otrovi deluju kao neurotoksini koji mogu da uzrokuju paralizu dovodeći do smrti i koriste se za odbranu od predatora ili za lov i hvatanje plena. Neki od ovih prirodnih inhibitora su, uprkos svojim toksičnim svojstvima, korisni za terapeutske svrhe pri niskim dozama.[102] Primer neurotoksina su glikoalkaloidi, iz biljnih vrsta familije (koja obuhvata krompir,[103] paradajz i plavi patlidžan), koji su inhibitori acetilholinesteraze. Inhibicija ovog enzima uzrokuje nekontrolisano povišenje nivoa neurotransmitera acetilholina, mišićnu paralizu i zatim smrt. Neurotoksičnost takođe može da bude posledica inhibicije receptora; na primer, atropin iz velebilja () koji funkcioniše kao konkurentni antagonist muskariničkih acetilholinskih receptora.[104]
Iako su mnogi prirodni toksini sekundarni metaboliti, ovi otrovi obuhvataju i mnoge peptide i proteine. Primer toksičnog peptida je alfa-amanitin,[105] koji se nalazi u srodnim vrstama pečurke zelena pupavka. U pitanju je potentan enzimski inhibitor. U ovom slučaju dolazi do sprečavanja enzima RNK polimeraza da transkribuje DNK.[106] Toksin iz algi mikrocistin je takođe peptid. On inhibira proteinske fosfataze.[107] Ovaj toksin može da kontaminira zalihe vode nakon cvetanja algi; poznati je karcinogen koji uzrokuje akutno krvarenje jetre i smrt pri većim dozama.[108]
Proteini mogu da budu budu prirodni otrovi ili antinutrijenti, kao što su tripsinski inhibitori (opisani iznad), koji su prisutni u nekim mahunama, kao što je prikazano na levoj slici iznad. Manje zastupljena klasa toksina su toksični enzimi: oni deluju kao ireverzibilni inhibitori svojih ciljnih enzima i hemijski modifikuju supstratne enzime. Primer ovakvog enzima je ricin, ekstremno potentan proteinski toksin prisutan u biljci .[109][110][111] Ovaj enzim je glikozidaza[112][113] koja inaktivira ribozome. Pošto je ricin katalitički ireverzibilan inhibitor, moguć je scenario gde samo jedan molekul ricina može da ubije ćeliju.[114]
Remove ads
Jedan od pristupa otkrivanju lekova se sastoji od ispitivanja potencijalnih terapeutskih kompleksa za biološku aktivnost, te naknadnog bavljenja pitanjem mehanizma. Za mnoge lekove, način delovanja još uvek nije jasan, čak ni nakon mnogo godina kliničke upotrebe. U poslednjih nekoliko godina, veliki napredak u rasvetljavanju molekularnih struktura omogućio je precizno određivanje interakcija između proteina i terapijskih sredstva. Ovim je pojašnjen mehanizam mnogih agenasa i omogućeno je informisano predviđanje potencijalnih mesta vezivanja leka. Identifikacija tačne prirode interakcija leka je ključna za kontrolisanje njegove specifičnosti, a time i za smanjenje neželjenih dejstava (nuspojava).[115]
Detaljne strukturne informacije se mogu koristiti za dizajniranje molekula koji se vezuju za specifične ciljeve, a većina ovih napora je usmerena na enzime. Supstratna specifičnost enzima koja omogućava prepoznavanje pojedinačnih molekula, pruža mogućnost konstruisanja lekova sa dobro definisanim ponašanjem.[116] Smatra se da su enzimi prirodne meta neorganskih lekova,[117] pošto metali imaju ključne strukturne uloge u mnogim enzimima, na primer u cinkovim metaloenzimima.[118][119] Perturbacije endogenog metala koji je od vitalnog značaja za enzimsko dejstvo mogu da dovedu do inaktivacije enzima. Ovi poremećaji mogu da budu izazvani uticajima kao što je koordinacija egzogenih liganada za metalom, supstitucija metala, ili uklanjanje metala. Neorganski kompleksi takođe mogu da utiču na enzime koji nisu metaloenzimi. Metali se mogu koordinirati sa ostacima aktivnog mesta i time blokirati supstratnu interakciju, ili se mogu koordinirati sa ostacima izvan aktivnog mesta i time uticati na strukturni integritet. Iako je lista inhibitora enzima koji se koriste kao terapeutski agensi u velikoj meri popunjena organskim molekulima, ti agensi međudeluju sa ciljevima putem slabih veza kao što su vodonične veze i Van der Valsovi kontakti. To potencijalno može da dovede do nuspojava usled kratkog intervala zadržavanja lekova u aktivnom mestu meta, te su moguće nespecifične interakcije sa molekulima koji nisu željena meta. Koordinaciona sposobnost metala može da proizvede jače interakcije, kao što su kovalentne i jonske veze.
Primena na normalnu i abnormalnu fiziologiju
Kancer
Jedan od najznačajnijih uspeha neorganskih lekova je bila efikasnost kompleksa platine protiv raka testisa.[120][121] Taj napredak je podstakao talas istraživanja s ciljem identifikacije novih neorganskih agenasa za upotrebu u hemoterapiji, koji bi imali poboljšanu specifičnost i manje izražene toksične nuspojave. Mehanizam antineoplastičnog dejstva cisplatina i njegovih derivata je identifikovan kao direktna interakcija sa DNK, mada brojni izveštaji sugerišu da platina isto tako ima enzimske mete.[122] Inhibicija RNK polimeraze,[123] DNK polimeraze (mogućeg ometanja funkcionisanja cinkovog prsta),[124] ilealne monoaminske oksidaze (što je vezano za sporedne efekte hemoterapije: mučninu i povraćanje),[125] CTP sintaze,[126] adenilat ciklaze (u vezi sa stepenom ototoksičnosti hemoterapije)[127][128] i drugih respiratornih enzima,[129] bili su uočeni. Preinkubacija prečišćenog enzima sa kompleksima platine pokazala je da dolazi do direktne interakcije između njih, ali je u mnogim slučajevima vezivanje platine za ciljni enzim takođe doprinelo inhibiciji. Inhibicija enzima može da doprinese nekim od neželjenih toksičnih efekata lekova na bazi platine; bolje razumevanje interakcija sa tim kompleksima je potrebno da be se umanjile neželjene posledice hemoterapije.
Platinski lekovi su jedan od primera u kome je primećen terapeutski efekat leka pre nego što je otkriven mehanizam dejstva. Alternativni pristup je dizajn leka sa određenom metom na umu. Traženi su specifični ciljevi koji igraju ključne uloge u metabolizmu ćelija raka, koji su jedinstveni za ćelije kancera ili su različito izraženi u ćelijama raka. Ribonukleotidna reduktaza je jedan takav molekul koji se pokazao kao obećavajuća meta za terapiju raka.
Ribonukleotidna reduktaza obavlja ključni korak koji ograničava brzinu sinteze DNK putem kontrole proizvodnje četiri dezoksiribonukleotidna građevna bloka. Ovaj enzim redukuje 2' ugljenik riboze na difosfatnom nivou.[130] Enzim se sastoji od dve dimerne podjedinice (zvane 1 i 2 u starijim izveštajima, ili 1 i 2 u skorijim publikacijama), koje su kodirane sa dva različita gena pod zasebnom regulatornom kontrolom. Aktivnost samog enzima je zavisna od kompleksne alosterne regulacije različitim nukleotidima. 1 sadrži mesta vezivanja supstrata i regulatornih efektora, dok 2 sadrži ona binuklearnih, nehemni centar gvožđa i slobodnog tirozinskog radikala, koji su neophodni za funkcionisanje enzima. Ribonukleotidna reduktaza kontroliše ravnotežu dezoksiribonukleotide dostupnosti, a promene njene aktivnosti mogu da promene spontanu mutacionu brzinu ćelija.[130] Povećana aktivnost ribonukleotidne redutaze dovodi se u vezu sa stanjima bolesti, uključujući rak;[130][131] inhibicija ovog enzima je atraktivna meta za terapiju raka.
Izvestan napredak je napravljen u korišćenju galijum nitrata u inhibiciji ribonukleotidne reduktaze.[132][133][134] Galijum ima sličan jonski radijus kao i gvožđe i smatra se da ometa dostupnost gvožđa u 2 podjedinici. Inhibitorni efekat galijuma se povećava kada se isporučuje u kompleksu sa esencijalnim molekulom transporta gvožđa, transferinom. Ćelijske studije pokazuju da tretman sa transferin-galijumom () blokira ćelijsku apsorpciju 59 i inhibira proliferaciju.[133] Umanjena aktivnost ribonukleotidne reduktaze ogleda se u inhibiciji signala iz tirozinskog slobodnog radikala na 2 podjedinicu ribonukleotidne reduktaze. Ovi efekti mogu biti preokrenuti izlaganjem feroamonijum sulfatu, što ukazuje da inhibicija utiče na proces zavisan od gvožđa. Ovi rezultati ne isključuju efekte na drugim putevima zavisnim od gvožđa, što takođe može da utiče na proliferaciju ćelija. Studije u sistemu bez ćelija u kojima se direktno testira aktivnost enzima pokazuju da galijum inhibira aktivnost enzima; autori pretpostavljaju da galijum formira galijum-, ili galijum- komplekse, čime kompetitivno inhibira interakciju supstrata sa enzimom.[134] Ni jedna od ovih studija ne daje odgovor na pitanje da li se galijum može zameniti gvožđem u 2 podjedinici i da li je tako supstituisani enzim i dalje aktivan. Galijum takođe sinergistički deluje sa brojnim drugim inhibitorima ribonukleotidne reduktaze na onemogućavanju ćelijske proliferacije. Njegovo dejstvo je antagonističko u odnosu na druge inhibitore ribonukleotidne reduktaze.[132] Ove opservacije imaju značajne posledice za kombinovanu terapiju, mada precizan mehanizam sinergizma nije poznat.
Drugi joni su takođe istraživani u pogledu uticaja na ribonukleotidne reduktaze. Poznato je da gvožđe, bakar i cink utiču na rast ćelija i regulišu komponente ciklusa transporta gvožđa. Studije o uticaju tih jona na ribonukleotidnu reduktazu u sveže izolovanim normalnim i leukemijskim ljudskim limfocitima pokazale su da cink inhibira enzim u oba tipa ćelija, dok i imaju stimulativne efekte.[130][131] Ovi rezultati mogu imati implikacije za modulaciju efekata inhibitora ribonukleotidne reduktaze tragovima metala.
| Primene na tretman kanceraa | |||
|---|---|---|---|
| Kompleks | Metal | Enzim | |
| transferin- | joni | ribonukleotidna reduktaza[133][134] | |
| karbotioamid | , | ribonukleotidna reduktaza[135][136] | |
| tiosemikarbazoni | ribonukleotidna reduktaza, RNK- -zavisne DNK polimeraze[137] | ||
| joni | ribonukleotidna reduktaza[131] | ||
| joni | ribonukleotidna reduktaza[132] | ||
| antraciklin, joni | proteinska kinaza [138] | ||
| selenocistein/glutation | proteinska kinaza [139][140] | ||
| metaloceni | , | proteinska kinaza , topoizomeraza [141] | |
| bipiridinski fenantrolin | , | RNK polimeraza[123] | |
| streptonigrin | , , , , | topoizomeraza , reverzna transkriptaza (putem formiranja slobodnih radikala)[142] | |
| 2, | DNK polimeraza[124] | ||
| cisplatin, bakar sulfat | , | ilealna monoaminska oksidaza[125] | |
| , 24 | sintaza[126] | ||
| joni | kaspaza-3[143][144] | ||
| razni | ornitinska dekarboksilaza[145] | ||
| , tetraplatin, karboplatin | respiratorni enzimi[128] | ||
| cisplatin | adenilatna ciklaza[127] | ||
| tetraplatin | adenilatna ciklaza[128] | ||
| vanadat, peroksovanadijum | proteinske tirozinske fosfataze[146][147] | ||
| jon | fosfoproteinska fosfataza[148] | ||
| metalni helator | matrilizin[149] | ||
a Napomena: U ovoj i narednim tabelama oksidaciono stanje metalnog jona nije prikazano radi jasnoće. Dodatne informacije su date u tekstu. | |||
Za metalne komplekse karbotioamida[135][136][150] i tiosemikarbazona[137] je utvrđeno da inhibiraju ribonukleotidnu reduktazu i imaju antikancerogeno dejstvo. Utvrđeno je da metalni kompleksi α-()-heterocikličnih karboksialdehidnih tiosemikarbazona (α-) inhibiraju rast ćelija u većoj meri nego slobodni ligand.[136] Metalni kompleksi 2,2'-bipiridil-6-karbotioamida (), koji su strukturno i funkcionalno slični α-, ne pokazuju tako jasno dejstvo. Studije gvožđa i bakra u kompleksu sa su pokazale da ima veći afinitet za bakar; bakarni kompleks pokazuje izraženije antitumorsko dejstvo od slobodnog liganda ili kompleksa gvožđa. Studije sa slobodnim ligandom međutim nisu jasne, jer je verovatno da ligand formira komplekse sa raspoloživim metalnim jonima u rastvoru. Smatra se da dozimetrija kompleksa može da utiče na učinak. Na primer, bakarni kompleks ima najjači antiproliferativni efekat na kultivisanim mišjim leukemijskim ćelijama nakon pulsnog kontakta, dok je u slučaju kontinuiranog kontakta manje aktivan od slobodnog liganda. Osim toga, izgleda da različiti metalni kompleksi deluju različitim mehanizmima. Dok se antiproliferativni efekat kompleksa gvožđa može objasniti inhibicijom ribonukleotidne reduktaze i veruje se da zapravo uništava 2 podjedinicu, postoje indikacije da kompleks bakra takođe deluje na druge ciljeve.[150][151] Potvrđeno je da sinergistički deluje sa inhibitorom ribonukleotidne reduktaze hidroksiurejom (), što sugeriše mogućnost kombinovane terapije.
Još jedna enzimska meta za agense protiv kancera je proteinska kinaza C (). je familija serin/treoninskih kinaza koje se aktiviraju sekundarnim glasnicima poput 2+ i produktima fosfolipidne hidrolize (iz kaskade inozitol trifosfata). Devet različitih članova ove porodice je do sada okarakterisano i oni učestvuju u različitim ćelijskim aktivnostima, uključujući transdukciju signala, rast ćelija/diferencijaciju i hormonsku sekreciju.[138] Oni su takođe poznati kao receptori forbolnih estara (poznatih hemijskih aktivatora), a aktiviraju se i u odgovoru na oksidativne promotere tumora.[139] Inhibicija je od interesa kao način sprečavanja formiranja tumora. Nedavni dokazi ukazuju na to da je regulatorni domen, koji ima dva homologna regiona sa šest očuvanih cisteina i dva konzervisana histidina, te sadrži nepremošćena 2+ mesta.[152] Protivtumorska sredstva koja deluju na obuhvataju antracikline, čije je dejstvo posredovano koordinacijom s prelaznim metalima. Jedna studija na prečišćenom je pokazala da antraciklin-() kompleks efikasnije inhibira nego pojedinačne komponente i da je taj efekat posredovan direktnom interakcijom između () i (ovaj zaključak je izveden iz studija).[138] Isto tako je pokazano da antraciklini imaju različite efekte na DNK topoizomerazi ,[153] mada još uvek nema izveštaja o dejstvu kompleksa prelaznih metala sa antraciklinima u ovom vidu primene.
Pojedina jedinjenja selenijuma imaju inhibitorni efekat na , a takođe imaju kancerpreventivno dejstvo.[139][140] Rezultati istraživanja sugerišu da ta jedinjenja inaktiviraju putem redoks mehanizma, reagujući sa cisteinima unutar katalitičkog domena.[139] U jednoj studiji je pokazano da jedinjenja selenijuma inhibiraju , dok na druge testirane proteinske kinaze nemaju uticaja (na fosforilaznu kinazu i proteinsku fosfatazu 2A). Međutim, postoji mogućnost da ova jedinjenja reaguju sa drugim proteinima koji sadrže klastere cisteina.
Metaloceni su klasa antitumornih agenasa koji ne sadrže platinu i koji deluju na različit način od lekova baziranih na platini.[154][141] Pojedini metaloceni se vezuju za terminalne fosfate i/ili baze nukleotida, dok drugi ne međudeluju sa nukleotidima.[141][155][156] Iz tog razloga je predložen niz alternativnih ciljeva. Pokazano je da () i () jedinjenja inhibiraju i topoizomerazu .[141] Jedinjenja niobijuma () ne vezuju se za nukleotide ili aminokiseline.[155] Mehanizam dejstva ove klase zahteva dalja istraživanja.
Jedinjenja vanadijuma, koja su najbolje poznata kao insulinski mimetici, isto tako ispoljavaju antikancerne efekte. Ova jedinjenja, konkretno kompleksi vanadata i peroksovanadijuma, kompetitivni su inhibitori proteinske tirozinske fosfataze (). Vanadati deluju kao analozi prelaznog stanja reverzibilnim vezivanjem za tiolnu grupu u katalitičkom domenu, dok peroksovanadijumski kompleksi oksiduju kritične cisteinske ostatke u katalitičkom domenu.[146] U serin/treoninskim fosfatazama, vanadati se vezuju za hidroksilnu grupu u aktivnom mestu, dok su peroksovanadijumski kompleksi neaktivni u odsustvu cisteina. Peroksovanadijumski kompleksi mogu da blokiraju ćelijski ciklus u fazi 2- tranzicije (2 = faza rasta 2, preparatorna fazi mitoze; = mitoza, period aktivne ćelijske podele); smatra se da je to uzrokovano inhibicijom , čije funkcionisanje je esencijalno za progresiju mitoze.[146][147] Moguće je da je ova blokada povezana sa njihovim citotoksičnim dejstvom. Serin/treoninske fosfataze su takođe inhibirane brojnim jonima prelazih metala d-bloka, među kojima su najefektivniji 2+, 2+, 2+, 2+ i 2+ (μ ).[148]
Doksorubicin
Epirubicin
Brojne druge enzimske mete za antikancerne agense takođe su istraživane. Ornitinska dekarboksilaza, koja se može indukovati forbolnim estrima i koja učestvuje u ćelijskoj transformaciji, može se inhibirati jedinjenjima galijuma.[145] Transformacija je povezana sa ćelijskom tranzicijom u kancerozno stanje. Ta jedinjenja inhibiraju rast tumora i smatra se da isto tako deluju na ribonukleotidne reduktaze. Matrične metaloproteinaze učestvuju u remodelovanju ekstracelularne matrice, što je ključno za invaziju tumora i metastazu u tkivima. Ljudska matrična metaloproteinaza matrilizin je enzim cinka za koji je pokazano da se inaktivira u rastvoru kadmijuma, koji formira neaktivni / hibrid.[149] Matrilizin se isto tako može inhibirati agensima metalnog vezivanja, kao što je 1,10-fenantrolin, koji formira enzim-helat-metal kompleks uz naknadno uklanjanje katalitičkog jona cinka.[149]
Apoptoza, koja je postala prominentno polje istraživanja poslednjih godina, proces je „programirane” ćelijske smrti. Postoji korelacija između defekata apoptoznih procesa i brojnih bolesti, uključujući kancer. Poznato je da 2+ sprečava apoptozu i pokazano je da do toga dolazi putem inhibiranja kaspaze-3, apoptotičke proteaze koja učestvuje u proteolizi poli(-riboza) polimeraze ().[143][144] Konfliktni izveštaji ne uzimaju u obzir inhibitorno dejstvo cinka na kaspazu-3.[157] Smatra se da su nesuglasice posledica razlika u eksperimentalnim uslovima: inhibicija uočena u slučaju prečišćenog rekombinantnog proteina ali ne i kod proteina u prisustvu lizata, sugerišu postajanje faktora u lizatu koji ometaju dejstvo cinka.
Postoje brojni agensi koji deluju putem inhibicije enzima koji deluju na DNK. Ova inhibicija je često posledica vezivanja za mesto kojim enzim formira interakcije sa DNK i nije rezultat direktne inaktivacije enzima.[153][158][159][160]
Imajući u vidu prirodu interakcija enzima i supstrata, izbor enzima kao ciljeva antikancernih lekova omogućava izuzetno specifično prepoznavanje ciljeva. Razvoj sofisticiranijih tehnika modelovanja i dostupnost detaljnijih informacija o strukturama enzima doveli su do rigorozne karakterizacije interakcija leka i enzima, te razjašnjavanja mehanizma dejstva. Većina publikacija u literaturi o kanceru se bavi inhibicijom specifičnih enzima, povremeno onih koji učestvuju u metaboličkim procesima. U tim istraživanjima se koriste prečišćeni enzimi ili testovi kojima se ispituju pojedinačni enzimi od značaja. Dok je krucijalno da se odrede inhibitorne osobine na ciljnom molekulu, isto tako je neophodno da se demonstrira da jedinjenje nije aktivno na drugim enzimima. Ovaj tip studija je tegoban pošto se može testirati samo relativno mali broj reprezentativnih enzima, pa se lako može propustiti enzim koji negira specifičnost. Pažljivim razmatranjem mesta delovanja leka može da se omogući izvođenje relativno dobrih prognoza o mogućim interakcijama sa drugim enzimima. Dodatni izazov je da su enzimske mete često prisutne i u normalnim ćelijama. Dizajn efektivnih antikancernih agenasa je komplikovan proces koji ne obuhvata samo inherentna inhibitorna svojstva leka, nego i njegovu isporuku, dozimetriju i vreme zadržavanja in vivo. Metalni kompleksi prevazilaze neke od ovih izazova formiranjem jakih kovalentnih veza sa ciljnim enzimima.
Primene vezane za hem
- Hiperbilirubinemija
| Hiperbilirubinemija | |||
|---|---|---|---|
| Kompleks | Metal | Inhibirani enzim | |
| joni | citohrom -450, ω-hidrolaza[161] | ||
| protoporfirin () | , | 11β-hidroksilaza, 21-hidroksilaza, citohrom -450, hem oksigenaza[162][163][164] | |
| mezoporfirin () | hem oksigenaza (tanko crevo)[165] | ||
| deuteroporfirin 2,4-bisglikol () | hem oksigenaza (pacov)[166] | ||
| hem oksigenaza (pacov)[167] | |||
| hem oksigenaza slezine (moždane membrane pacova)[168] | |||
| , , | hem oksigenaza (pacov)[169] | ||
| razni porfirini | , , | γ-aminolevulinatna sintaza (ćelije jetre kokošjeg embriona), hem oksigenaza 56 | |
| razni porfirini | , , , | hem oksigenaza (epitel tankog creva)[170] | |
| mezoporfirin | klinička supresija hiperbilirubinemije[171][172] | ||
Hiperbilirubinemija je oboljenje koje uzrokuje prekomernu akumulaciju bilirubina u krvi i tkivima.[173] Bilirubin je produkt katabolizma hema, pri čemu se hem degradira posredstvom hem oksigenaze () i formira se biliverdin, koji se zatim redukuje pomoću biliverdin reduktaze do bilirubina.[174] Nakon konjugacije sa glukuronskom kiselinom, pomoću enzima bilirubin glukuronid transferaza, i formiranja rastvorljivijeg konjugata, bilirubin se izlučuje. Prekomerno razlaganje hema i nedovoljna aktivnost transferaze mogu da dovedu do akumulacije bilirubina. Ovo nakupljanje je poznato kao neonatalna žutica kod beba sa nedovoljno razvijenom jetrom i prevremeno rođene dece, koja brzo razgrađuju hem (pri prelazu sa fetalnog na regularni hemoglobin) ali im nedostaju adekvatne transferaze. Hiperbilirubinemija se takođe javlja kod genetičkog Krigler—Najarovog sindroma, gde dolazi do kompletnog odsustva transferaznog dejstva u jetri[171] i drugih bolesti kao što su talasemija i kongenitalne anemije.[174] Inhibicija razlaganja hema u hem oksigenaznom koraku je mogući način sprečavanja hiperbilirubinemije.
Metaloporfirini su ekstenzivno izučavani i dobro poznati inhibitori hem oksigenaze. Ovi inhibitori se vezuju za katalitičko mesto, ali nisu efektivni supstrati. Znatan broj metaloporfirina ima inhibitorno dejstvo, a ima i onih koji indukuju hem oksigenazu. Najznačajniji inhibitori hem oksigenaze su kalajni i cinkovi porfirini. Neki od ovih porfirina su našli kliničku primenu u suzbijanju produkcije bilirubina.[171][172] Nedavna istraživanja su razjasnila prirodu inhibicije, uticaj na druge biohemijske puteve, kao i opseg biodistribucije lekova.
Studije cinkovih i kalajnih protoporfirina indiciraju da je kalajni protoporfirin () isto tako efektivan inhibitor adrenalne steroidogeneze, dok cinkov protoporfirin () nema uticaja na taj put.[162][163] Sinteza steroida je posredovana brojnim hemoproteinima, citohromima -450, te postoji kompleksna međuzavisnost između puta sinteze hema i steroidogeneze. Koncentracija citohroma je vezana za promene u sintezi i degradaciji hema. U testovima, koristeći modele na pacovima, utvrđeno je da znatno redukuje aktivnost steroidnih biosintetičkih enzima mitohondrijske 11β-hidroksilaze i mikrozomalne 21-hidroksilaze; takođe je uočeno smanjenje sadržaja mikrozomalnog citohroma -450.[162][163] U pomenutoj studiji je isto tako zapaženo drastično smanjenje sadržaja -2, neinducibilnog izozima hem oksigenaze koji je daleko prevalentniji od inducibilnog -1, te se pretpostavlja da zapravo uništava -2 umesto da ga inhibira. , nasuprot ovoga, inhibira aktivnost ali nema uticaja na enzime steroidne biosinteze.[162][163]
Dalja istraživanje poređenjem dejstva i sa -1 i -2 pokazala su da su oba jednako inhibitorna za -1 bez uticaja na integritet proteina (što je utvrđeno vestern blot analizom), kao i da indukuju povišenje nivoa -1 transkripije. Međutim, i se razlikuju u pogledu svoje aktivnosti spram -2.[164] Mada oba inhibiraju -2, razlikuju se u stepenu inhibicije. Stepen inhibicije je isti za obe forme , dok ispoljava znatniju inhibiciju nego -1. Smatra se da poremećuje integritet -2 proteina (vestern blot), dok nema taj efekat. Mehanizam koji uzrokuje razlike aktivnosti i na formama nije poznat.
Utvrđeno je da razni porfirini inhibiraju intestinalnu hem oksigenazu i umanjuju preuzimanje gvožđa iz creva, dovodeći do povećanog izlučivanja ovog metala. To može da bude korisno u tretmanu slučajeva hemohromatoze.[170][165] Ovaj efekat je uočen kod svih parenteralno administriranih porfirina, ali su samo , i bili oralno efektivni (na intestinalnoj ; nisu nađeni na renalnim, splinskim ili hepatičim tkivima). Pokazano je da je efektivan u tretmanu akutne porfirije (poremećaja izazvanog deficijencijom hema), a studije distribucije u tkivu su pokazale da brzo biva uklonjen iz plazme i da se prvenstveno zadržava u jetri i slezini, gde inhibira tokom perioda od skoro nedelju dana nakon jedne injekcije.[167] ne prolazi kroz krvno-moždanu barijeru, za razliku od za koji je pokazano da štetno utiče na -2 integritet i aktivnost u mozgu pacova.[175] Metaloporfirini deluju kao pojačivači fotosenzitivnosti s varirajućim stepenima[176] (oni se takođe koriste u fotodinamičkoj terapiji). Poznato je da u manjoj meri podstiče fotosenzitivnost od , što je još jedno svojstvo koje sugeriše da su cinkove forme inhibitora verovatno podesnije za kliničku primenu.[166]
i takođe efektivno inhibiraju .[168][169] Utvrđeno je da ne posreduje lipidnu peroksidaciju u moždanim membranama pacova nakon fotoiradijacije (što je pokazano koristeći malondialdehidni test); stoga, on ne podstiče fotosenzitivnost.[168] efektivno inhibira hepatičku nakon oralne administracije, dok na splinsku nema uticaja.[169] Pokazano je da inhibira hepatičku 5-aminolevulinatnu sintazu (), enzim koji ograničava brzinu puta biosinteze hema. Ovaj efekat se uvećava kad se hem doda sa porfirinom.[177] Poznato je da gvožđe i hem povratno regulišu putem inhibiranja RNK transkripcije/transporta.[178] Uočeno je da je translacija pod kontrolom elemenata resposivnih na gvožđe.[179]
Upotreba metaloporfirina za tretman hiperbilirubinemije je uznapredovala dalje u procesu razvoja lekova u odnosu na antikancerne agense opisane u prethodnom odeljku. Ovi porfirini imaju poznat biološki cilj, hem oksigenazu, te je njihova klinička efektivnost već pokazana. Međutim, njihova glavna biološka meta je deo kompleksnog puta, koji je u velikoj meri povezan sa drugim procesima, kao što je steroidna sinteza. Neophodno je praćenje tih drugih procesa da bi se sprečili neželjeni uticaji na njih.
- Transdukcija azot-monoksidnog signala
| Transdukcija azot-monoksidnog signala | |||
|---|---|---|---|
| Kompleks | Metal | Inhibirani enzim | |
| rastvorna guanilatna ciklaza (prečišćena)[180] | |||
| , | , | rastvorna guanilatna ciklaza (pacovi)[181] | |
| natrijum nitroprusid () | azot-monoksid sintaza (neutrofili pacova)[182] | ||
| (cerebralni kortikalni sinaptozomi)[183] | |||
| joni | , , , , | (prečišćena)[184] | |
| jon | (prečišćeni )[185] | ||
| ekto-5'-nukleotidaza (renalno epitelijalna)[186] | |||
| indolamin 2,3-dioksigenaza (mononuklearni fagociti)[187] | |||
| metionin sintaza[188] | |||
| (+/+)-aza[189] | |||
Azot-monoksid () igra ulogu glasnika u mnoštvu sistema. U imunskom sistemu, posreduje respons belih krvnih zrnaca na patogene; u kardiovaskularnom sistemu, indukuje relaksaciju ćelija glatkih mišića u krvnim sudovima; i u nervnom sistemu, učestvuje u neurotransmisiji i neuromodulaciji.[190][188][191] se formira iz -arginina posredstvom azot-monoksidne sintaze (), hem proteina koji se javlja u više izoformi i za čije dejstvo je neophodan kao donor elektrona. Postoje tri izoforme: konstitutivne izoforme prisutne u mozgu (, tip ) i endotelnim ćelijama (, tip ) za čije dejstvo je neophodan kalcijum/kalmodulin, i citokinom indukovane forme (, tip ) za čije dejstvo nije neophodan kalcijum ali koje imaju kalmodulin kao čvrsto vezanu podjedinicu.[192] Obe klase se javljaju u obliku homodimera pri čemu svaka podjedinica sadrži 1 ekvivalent , , (6)-5,6,7,8-tetrahidro--biopterina () i protoporfirin hema.[184][193] Postoji duga lista inhibitora koja obuhvata selenoorganska jedinjenja (koja se vezuju za tiolne grupe), porfirine, te cink (vezuje se za hem mesta).[193] U kaskadi prenosa signala, poznato je da stimuliše guanilatnu ciklazu i da indukuje akumulaciju sekundarnog glasnika, . Mnogi aspekti signalizacije su ispitani studiranjem ramifikacija uvođenja donora u sistem ili putem inhibiranja čime se obustavlja produkcija.
je našao široku primenu kao ligand u gvožđe-hemnim kompleksima u neorganskoj hemiji, i stoga se nameće pitanje da li može da bude autoregulisan inhibicijom (hemni je protein).[192] Studije sa donorom, natrijum nitroprusidom (), 2()5•22, pokazuju da može da inhibira .[182][182] U studijama sa neutrofilima pacova, lipopolisaharid se koristi za indukovanje aktivnosti i ova indukcija se inhibira pomoću .[182] ispitivanja koristeći kortikalne sinaptozome pacova su ukazala na postojanje koncentraciono zavisne inhibicije aktivnosti.[182] U ovim studijama se aktivnost određuje praćenjem formiranja [3]citrulina iz [3]arginina.[194] Poznato je da prelazni metali inhibiraju ,[184] kao i da prečišćeni 2+, 2+, 2+ i 2+ deluju kao inhibitori inducibilnog enzima, dok nehemno gvožđe povećava katalitičku aktivnost. Za 2+ jon je utvrđeno da inhibira prečišćeni neuronalni (drugi metali nisu testirani na ). Iz ovih nalaza proizilazi da nehemno gvožđe enzima učestvuje u katalizi, te da verovatno sadrži aktivno mesto za nehemno gvožđe/.
2+ reverzibilno inhibira aktivnost ( = 30 μ).[185] Uočena je inhibicija -zavisne redukcije gvožđa hema i od kalmodulina ()-zavisna redukcija citohroma . Nije uočena inhibicija -nezavisne reduktaze citohrom reduktaze (mereno relativnim brojem katalitičkih ciklusa citohroma ). Međutim, čak i u odsustvu 2+, -nezavisni put ima više nego deset puta slabiju aktivnost od -zavisnog puta. spektri razlika tipa demonstriraju smanjenje količine visokospinskog gvožđa hema u prisustvu 2+. Na osnovu ovih rezultata, zaključeno je da do inaktivacije enzima dolazi usled vezivanja 2+ za sulfhidrile u blizini hem liganda i naknadnog poremećaja okruženja oko gvožđa hema.
i produkcija doprinose inhibiciji niza drugih enzima. Indolamin 2,3-dioksigenaza () enzim je koji sadrži hem i koji je deo interferonom γ (γ) indukovanog responsa mononuklearnih fagocita na patogene.[187] je enzim koji ograničava brzinu u putu degradacije triptofana. Iscrpljivanje triptofana, najmanje dostupne esencijalne aminokiseline, može da doprinese antipatogenoj aktivnosti mononuklearnih fagocita. U studijama na izolovanim γ-tretiranim ljudskim perifernim krvnim mononuklearnim ćelijama i iz monocita izvedenim makrofagama, uočeno je da inhibira aktivnost.[187] Takođe je pokazano da se može inhibirati dejstvom .[195] Drugi enzimi koje inhibira obuhvataju metioninsku sintazu u hepatocitima pacova,[188] (+/+)-aze[189] i ekto-5'-nukleotidaze u renalnim epitelijalnim ćelijama.[186] Metioninska sintaza se sastoji od metilkobalamina kao kofaktora, derivata vitamina B-12 koji je u znatnoj meri sličan hemoglobinu, a do inhibicije može doći putem formiranja -kobalaminskog kompleksa. Smatra se da do inhibicije ekto enzima dolazi putem -nitrozilacije. Mehanizam inhibicije (+/K+)-aze nije poznat.
Postoje indikacije da je ugljen-monoksid () fiziološki regulator, koji deluje na sličan način kao i , uključujući sposobnost stimulacije guanilil ciklaze. se formira posredstvom , pri konverziji hema do biliverdina i . Mnoge studije uloge su izvršene koristeći inhibitore, kao što su i , da bi se pokazalo da supresija (i stoga produkcije) inhibira guanilil ciklazu. Međutim, nedavne studije su pokazale da sami metaloporfirini inhibiraju guanilil ciklazu, te stoga studije koje koriste te komplekse za ispitivanje uticaja verovatno treba preispitati.[180][181] U drugim studijama su korišćeni porfirini za ispitivanje uloge u prostornom učenju i dugoročnoj potencijaciji u hipokampusu.[196][197] Porfirini su korišćeni pod pretpostavkom da oni isključivo deluju kao supresori produkcije posredstvom ; međutim, imajući u vidu da je dejstvo porfirina višestrano, teško je pretpostaviti ulogu isključivo na bazi tih eksperimenata. Ove studije demonstriraju neke od problema sa kojima se istraživači suočavaju kad specifičnost inhibitora nije apsolutna i ilustruju neke od komplikujućih faktora u analizi podataka kad se koriste „indirektni” efektori (npr. inhibiranje enzima koji formira , umesto direktnog uklanjanja ).
Hipertenzivne primene
| Hipertenzivne primene | |||
|---|---|---|---|
| Kompleks | Metal | Inhibirani enzim | |
| sulfonamid | karbonatna anhidraza[198] | ||
| heterociklični sulfonamidi | , | karbonatna anhidraza[199] | |
| heterociklični merkaptani, sulfenamidi, sulfonamidi | , | karbonatna anhidraza[200] | |
| razni sulfonamidi | , | karbonatna anhidraza[201] | |
| hlorotiazid | , | karbonatna anhidraza[202] | |
| kaptopril | angiotenzin konvertujući enzim[203] | ||
| lisinopril | angiotenzin konvertujući enzim[204] | ||
Sistemi vezani za hem koji su razmatrani u prethodnom odeljku blisko su povezani sa hipertenzivnim primenama. Natrijum nitroprusid je u širokoj upotrebi kao hipotenzivni agens,[188][205] a hem oksigenaza je implicirana u održavanje krvnog pritiska.[161] Utvrđeno je da 2 indukuje -1 transkripciju i stoga inhibira dejstvo citohrom 450-arahidonska kiselina ω/ω-1 hidroksilaze, što dovodi do smanjenog formiranja ö/ö-1 hidroksilaznih metabolita i nižeg krvnog pritiska.[161] Hidroksilaza je hemni protein čiji su nivoi kontrolisani dostupnošću hema. Kad se indukuje hem oksigenaza iscrpi se dostupni hem; tome sledi opadanje nivoa enzima, a time i količine enzimskih metabolita. Metaboliti, odnosno 19[]-hidroksieikozatetraenoinska kiselina () i 20-, deluju kao prohipertenzivi jer stimulišu +/+-azu i konstrikciju krvnih sudova.
Još jedan od primarnih enzimskih ciljeva za hipertenziju je karbonatna anhidraza (). Ona katalizuje hidraciju 2 do bikarbonata i učestvuje u širokom opsegu bioloških procesa, uključujući homeostazu, produkciju okularnih i cerebrovaskularnih fluida, te sekreciju elektrolita. U očima, na primer, karbonatna anhidraza igra kritičnu ulogu u održavanju intraokularnog pritiska. Poznato je sedam izoenzima karbonatne anhidraze i nekoliko srodnih proteina. Ovi izoenzimi su prisutni u citosolu ( , , i VII), vezani za ćelijske membrane ( ), u mitohondrijama ( ) i u sekretornoj formi u pljuvački ( ).[206][207] Oni imaju različite uloge i veoma različitu tkivnu distribuciju, kinetička svojstva i osetljivost na inhibitore. enzimi su metaloenzimi, a mnogi inhibitori tih enzima su metal kompleksirajući anjoni koji se direktno koordiniraju sa cinkom u aktivnom mestu enzima.
Karbonatne anhidraze, izuzev , takođe inhibiraju sulfonamidi koji se vezuju za cink putem supstitucije katalitički važnog molekula vode.[200] Sulfonamidi su korišćeni za tretman glaukoma dugi niz godina jer snižavaju intraokularni pritisak (). Precizni mehanizam snižavanja pritiska nije poznat, ali se smatra da do toga dolazi usled redukcije koncentracije bikarbonata u posteriornoj komori oka, te da prateće premeštanje bikarbonatnih jona dovodi do kretanja fluida i smanjenja koncentracije natrijuma.[208] Metalni kompleksi sulfonamida takođe potentno inhibiraju karbonatne anhidraze. (), (), (), (), () i -() kompleksi adamantil sulfonamidnih derivata imaju inhibitorno dejstvo na tri izozima ( , i ) sa vrednostima.[199] () i () kompleksi, najjači inhibitori u seriji, topikalno su bili primenjivani na zečji model oka i utvrđeno je da snižavaju . Topikalno primenjeni sulfonamid ne snižava , iz čega sledi da prisustvo metalnih jona kritično menja svojstva inhibitora. Pretpostavlja se da metal menja rastvorljivost kompleksa, čime se povećava dostupnost leka. () kompleksi hlorotiazida, diuretika koji se koristi kao antihipertenziv, isto tako pokazuju jaku inhibiciju [202] kao i () i () kompleksi arilsulfonilamida[201] i () kompleksi acetazolamidnih derivata.[198] Za metalne komplekse se smatra da deluju na na dva načina: 1. inhibicijom sa slobodnim sulfonamidom i 2. interakcijom metalnih jona sa histidinom u aktivnom mestu.[198]
Veliki deo literature o hipertenzivnim agensima je posvećen inhibitorima angiotenzin-konvertujućeg enzima (), komponenti renin-angiotenzin sistema. Renin-angiotenzin sistem učestvuje u održavanju krvnog pritiska. katalizuje konverziju angiotenzina do angiotenzina , vazokonstriktora koji učestvuje u hipertenziji. Angiotenzin se formira konverzijom jetrenog produkta posredstvom renina, enzima koji izlučuju bubrezi.[209][210] Postoje receptorska mesta na mnogim organima za angiotenzin . Taj sistem može da bude blokiran na više nivoa, poznati β-blokatori blokiraju otpuštanje renina, analozi renin-supstrata i reninski inhibitori blokiraju renin, angiotenzin receptore blokira salarzin, a inhibitori blokiraju . Većina pomenutih jedinjenja ne sadrži metale, mada neki inhibitori formiraju metalne kompleksie in vivo. Na primer, kaptopril je dizajniran da se nadmeće sa angiotenzinom za jone cinka u enzimu i da vezuje cink putem tiolne grupe.[203] Lisinopril, još jedan inhibitor, vezuje cink putem aminokarboksilatne gurpe.[204] Lisinopril se konjuguje sa () i () (iminofosforano)fosfinima, a konjugati imaju nešto veću inhibitornu aktivnost od roditeljskog jedinjenja (dolazi do 18-strukog smanjenja vrednosti 50, nanomolarni opseg).[211] Ova derivatizacija u vidu sinteze 105 i 109 radio-obeleženih jedinjenja omogućava in vivo praćenje distribucije leka.
Tretmani za hipertenziju su obično dugoročni i stoga je stabilnost interakcija koju pruža kovalentno vezivanje metalnih kompleksa privlačna opcija. Najveći deo literature u ovoj oblasti se bavi organskim jedinjenjima; međutim, znatan broj tih jedinjenja je zavisan od interakcije sa metalima za ispoljavanje svog dejstva.
Serinskoproteazne primene
| Serinskoproteazne primene | |||
|---|---|---|---|
| Kompleks | Metal | Inhibirani enzim | |
| aminokiselinske i peptidne ligacije | α-himotripsin[212][213] | ||
| Šifova baza | trombin, termolizin[214][215][216] | ||
| razne boronske kiseline | tripsin[217] | ||
| peptid | α-litička proteaza[218] | ||
| fenilboronska kiselina | α-himotripsin[219] | ||
| tripeptid | tripsin, α-litička proteaza, tripsinu slične proteaze[220] | ||
| serinske proteaze[221][222][223][224] | |||
| titanil sulfati | tripsin[225] | ||
Serinske proteaze obuhvataju glavnu familiju proteolitičkih enzima sa raznovrsnim opsegom funkcija. Serinske proteaze igraju ključne uloge u kaskadi koagulacije krvi, u aktivaciji komplementa, bakterijskoj patogenezi, te fibrinolizi.[217] Serinske proteaze su postale prominentni ciljevi za dizajn lekova u antivirusnim i antibakterijskim istraživanjima.[225] Velika klasa inhibitora serinskih proteaza su boronske kiseline i peptid-boronske kiseline.[157][200][226][227] Smatra se da boronil grupe oponašanju prelazno stanje reakcije, dok peptidna porcija usmerava specifičnost na specifične proteaze.
Serije 15 i 1 studija kompleksa proteaznih inhibitora dale su uvid u interakcije između tripsina ili α-litičkih proteaza i raznih boronskokiselinskih inhibitora. U α-litičkim proteazama i tripsinu, supstratni analozi teže da formiraju serinske adukte, dok nesupstratni analozi obično formiraju histidinske adukte,[217] mada i supstratni analozi mogu ponekad da formiraju histidinske adukte.[218][228] Dalje, 11 studije na histidinskim aduktima α-litičkih proteaza i serinskih adukata himotripsina i α-litičkih proteaza pokazale su da je atom bora tetraedralan u histidinskim i serinskim aduktima.[218] Iz rada sa fenilboronskom kiselinom proizilazi da adicija šećera (-monosaharida) povećava inhibitorno dejstvo na α-himotripsin.[219] Taj zaključak je izveden na osnovu acidifikacije atoma bora putem samokompleksacije sa -monosaharidima. Ovaj sinergistički efekat je zavisan i nije uočen iznad 9,5 (enzimska inhibicija dejstvom same borne kiseline takođe nije uočena). Do jake inhibicije enzima dolazi između 4 i 9 u prisustvu fenilborne kiseline i fruktoze sa najvećim šećerno indukovanim pojačanjem inhibicije na aproksimativno neutralnom . Razni tripeptidi boronatnih estara takođe deluju kao inhibitori serinske proteaze.[220] Utvrđeno je da dodatni peptidno-metalni kompleksi deluju kao serin proteazni inhibitori. Poznato je da ()-vezane aminokiseline i dipeptidi mogu da inhibiraju himotripsin i tripsin.[212][213] Ove studije su provođene da bi se ispitali efekti pentamin kobalta(), koji se koristi kao hidrofilna karboksilna zaštitna grupa u enzimatskoj peptidnoj sintezi. Ranije je primećeno da prisustvo ove grupe na aminokiselinama neposredno pored veze koja je podložna enzimskom dejstvu blokira katalitičku konverziju. Inhibicija prečišćenog himotripsina i tripsina ligiranim peptidima je kompetitivna i reverzibilna. Naknadne studije ove hemijske grupe sugerišu da se ligirani peptidi vezuju za enzim putem Kulonovih interakcija.[213] Kobalt()-ligirani peptidi raznih dužina su testirani na tripsinu, himotripsinu i proteinazi . Na osnovu rezultata modelovanja himotripsina, rastojanje između dva negativno naelektrisana ostatka (-35 i -64) u ' vezujućem i -195 u aktivnom mestu odgovara dužini inhibitora peptida optimalne dužine. Redosled inhibicionih efikasnosti je metalopeptid > amid > slobodni peptid, što se podudara sa očekivanjima imajući u vidu postojanje dva negativno naelektrisana bočna lanca u mestu vezivanja. U prisustvu povišenih koncentracija , inhibicija metalopeptidima je manje efikasna, dok se inhibicija slobodnih peptida poboljšava. Do promene inhibicije amida ne dolazi. Ovi rezultati su konzistentni sa elektrostatičkim interakcijama između inhibitora i aktivnog mesta. Nasuprot ovome, tripsin ima dva pozitivno naelektrisana ostatka (-60 i -62) u ' vezujućem regionu i shodno tome inhibicija slobodnim peptidima je efektivnija od pozitivno naelektrisanih metalopeptida. Opservacije na proteinazi nisu konzistentne sa obrascem efikasnosti uočenim za druga dva enzima, što sugeriše da jedno pozitivno naelektrisanje (-218) u ' regionu ne određuje vezivanje. Te studije demonstriraju da adicija metalnog jedinjenja može da promeni afinitet vezivanja supstrata putem elektrostatičkih efekata.
U studijama kompleksa () Šifove baze i peptidnih konjugata tih kompleksa pokazano je da efektivno inhibiraju trombin i termolizin.[214][215][216] Peptidni konjugat selektivno inhibira trombin u smeši sa dve druge serinske proteaze (i = μ). Selektivnost proističe iz interakcije peptidne komponente, dok je sama inhibicija posledica kobalt() koordinacije sa histidinima aktivnog mesta. Alternativno, kobalt se može koordinirati sa histidinima u blizini ali ne i u samom aktivnom mestu, čime se peptid zaključava u mestu vezivanja supstrata. Takođe, pokazano je da ovi kompleksi imaju sposobnost vezivanja histidina u model sistemu peptida iz cinkovog prsta nukleokapsidnog proteina.[229] U ovim studijama je pomoću 1 spektroskopije demonstrirana direktna interakcija između kobaltnih kompleksa i histidina u cinkovom prstu, što dovodi do remećenja strukture cinkovog prsta. Iz pomenutih studija proističe da ovi kompleksi mogu da inhibiraju cinkove metaloproteaze.
Nakon što je klasa inhibitora cink-posredovanih serinskih proteaza okarakterisana,[221][222][223][224] u kristalografskim studijama na tripsinu je uočeno da se ti inhibitori tetraedralno koordiniraju sa egzogenim jonom cinka između dva helirajuća atoma azota inhibitora i dva ostatka aktivnog mesta (57 i 195).[222] Prisustvo cinka pojačava inhibiciju za skoro tri reda veličine, i u slučaju pojedinih inhibitora proizvodi selektivnost. Ova klasa inhibitora predstavlja jedinstven pristup u kojem sam inhibitor nije metalni kompleks ali je prisustvo prelaznog metala od ključnog značaja za inhibiciju.
Serinske proteaze su implicirane u procese brojnih bolesti, a inhibicija ovih enzima aktivno je polje izučavanja.[222][224] Prisustvo histidina u aktivnom mestu i afinitet jakih kiselina za azot čini inhibiciju serinskih proteaza pomoću metalnih kompleksa logičnim izborom. Nov pristup dizajnu inhibitora, kao što je opisano iznad, vezuje organska jedinjenja za aktivna mesta putem cinkovog jona kao „mosta” (granične Luisove kiseline), što sugeriše da cink možda deluje kao regulatorni element. Ovi mali molekuli predstavljaju potencijalni okvir za konstruisanje brojnih drugih inhibitora, gde inhibitorna porcija molekula ostaje nepromenjena, dok se ostatak molekula može prilagođavati da bi se promenila specifičnost.
Neurološke primene
| Neurološke primene | |||
|---|---|---|---|
| Kompleks | Metal | Inhibirani enzim | |
| jon | adenilatna ciklaza, triptofanska hidroksilaza, 2+-aza[230] | ||
| jon | serinske proteaze, α-himotripsin[231] | ||
| jon | monoaminooksidaza A[232] | ||
| jon | kalpain[233] | ||
| jon | kalpain, heksokinaza, glukoza-6-fosfat dehidrogenaza[234] | ||
| porfirini | , | acetilholinesteraza[235] | |
| porfirini | , | hem oksigenaza, azot-monoksid sintaza[196] | |
| protoporfirin | hem oksigenaza[197] | ||
| cisplatin, copper sulfate | , | monoaminooksidaza[125] | |
| jon | , , , , | lizozomna, citoplasmična proteinaza, kalpain i [236] | |
| jon | matrične metaloproteinaze, sekretaze, citohrom oksidaza, azot-monoksidna sintaza, endonukleaza[237] | ||
Jedna od najbolje poznatih oblasti primene metalnih inhibitora u neurologiji je upotreba litijuma kao tretmana za bipolarni poremećaj (manično-depresivnu bolest). Litijumska terapija je uvedena 1949. godine, ali precizni mehanizam njenog terapeutskog dejstva nije bio poznat. Poslednjih godina su objavljeni izveštaji koji indiciraju da litijum utiče na puteve inozitol fosfolipidne hidrolize (mada nije jasno da li je to usled inhibicije inozitol-1-fosfataze) i da inhibira adenilatnu ciklazu.[230]
Uloga aluminijuma u Alchajmerovoj bolesti i detaljni mehanizam njegovog učešća u razvoju bolesti nisu potpuno razjašnjeni. Povezanost aluminijuma sa bolešću je implicirana sticajem okolnosti usled povišenih nivoa aluminijuma u mozgu pacijenata sa Alchajmerovom bolešću i amiotrofičnom lateralnom sklerozom.[231][234][233] Aluminijumski sadržaj je visok u plakovima, neurofibrilarnim svežnjevima i neuritskim naslagama karakterističnim za pomenuta oboljenja. Aluminijum inhibira moždane heksokinaze[238] i nekompetitivno inhibira moždanu mitohondrijsku monoaminsku oksidazu- ()[232] (kao što je to slučaj sa crevnom , u kontekstu kancera). Postoje indikacije da aluminijum aktivira serinske proteaze, i da su tako aktivirane proteaze naknadno otporne na dejstvo drugih inhibitora.[231][234] Serinske proteaze presecaju β-amiloidne prekursorske proteine () i formiraju β-amiloidne peptide. Predložen je model po kojem aluminijum supresuje inhibitorski domen proteaza, čime pospešuje proteolitičko formiranje peptida koji se zatim akumuliraju i iniciraju formiranje plakova.[231]
Niz drugih metala je bio impliciran u formiranje amiloidnih plakova. Primećeno je da 2+, 2+ i 2+ (μ), kao i 2+ (), uzrokuju agregaciju pri fiziološkim koncentracijama β-amiloidnih proteina.[239][240][237][241][242][243] Histidinski modifikovan ljudski beta(1-40) ne podleže agregaciji posredstvom 2+, 2+ ili 2+, iz čega proizilazi da histidini učestvuju u metalom indukovanoj agregaciji.[239] Postoje indikacije da metali deluju putem različitih mehanizama. 2+-indukovana agregacija je inhibirana prisustvom antioksidanasa, dok oni nemaju uticaja na 2+-indukovanu agregaciju. Ovaj nesklad sugeriše da 2+ uzrokuje agregaciju putem oksidativnog mehanizma.[240] Poznato je da oksidacija može da indukuje agregaciju,[244] te da β-amiloidi imaju prooksidantna svojstva — posebice u prisustvu aluminijuma.[245] Azot-monoksidni donori kao što je (koji formiraju usled oksidativnog stresa) mogu da posreduju akumulaciju cinka u hipokampalnim ćelijama, te postoji mogućnost da su oksidativni efekti povezani sa cinkovim efektima.[237] Za razliku od toga, mehanizam 2+-indukovane agregacije nije zavisan od oksidacije, nego se zasniva na direktnim interakcijama sa peptidima.[239][240][242][243] Pored svog agregacionog dejstva, 2+ inhibira brojne proteolitičke enzime koji učestvuju u transformacijama amiloida, uključujući matriks metaloproteinaze () odgovorne za degradaciju amiloidnih peptida, a verovatno i α-sekretaze odgovorne za presecanje amiloidnog prekursorskog proteina.[237] Inhibicija proteolize se ostvaruje putem dva različita vida dejstva metala na supstrate: 1. ima mesto vezivanja za 2+ i nakon vezivanja dolazi do inhibicije presecanja na α-sekretaznom mestu, i 2. enzimi ne presecaju agregirane amiloide. Za bakar i kobalt (50 μ) utvrđeno je da inhibiraju presecanje.[246] Direktna interakcija sa sekretazama nije potvrđena u studijama.
Osim amiloidnih plakova, Alchajmerovo moždano tkivo karakterišu neurofibrilarni spletovi. Istražuje se mnoštvo različitih faktora da bi se utvrdio uzrok ovog fenomena, uključujući abnormalni transport neurofilamenata i abnormalnu degradaciju. Pokazano je da aluminijum inhibira kalcijumom aktiviranu neutralnu proteinazu (kalpain ) koja posreduje razlaganje neurofilamentnih podjedinica i citoskeletalnih proteina.[233] 3 i aluminijum laktat inhibiraju prečišćeni kalpain , iz ljudskog cerebralnog korteksa, sa 50 vrednošću od 200 μ i 400 μ, redom. Inhibicija dejstva kalpaina je posledica direktne interakcije sa enzimom, pošto preinkubacija supstrata [14]metilazokazeina sa aluminijumom nema efekta na inhibitornu efikasnost. Aluminijumska inhibicija isto tako obuhvata interakciju sa citoskeletalnim proteinima, i u nekim slučajevima (npr. kod neurofilamentnih podjedinica i ) aluminijum indukuje formiranje nerastvornih kompleksa uree. Stoga je inhibicija proteolize aluminijumom višestruki proces koji obuhvata direktno vezivanje za enzim, vezivanje za supstrat čime se ometa proteoliza, te formiranje supstratnih kompleksa koji su otporni na proteolizu. Aluminijum ima visok afinitet za fosfate i smatra se da se vezuje za fosforilisane grupe na neurofilamentnim proteinima.[233] Uprkos ovim interakcijama, mehanizam inhibicije kalpainina nije rasvetljen.
Takođe je pokazano da aluminijum inhibira metaboličke enzime u mozgu, čime se proizvode metaboličke greške. Moguće je da akumulacija takvih metaboličkih grešaka doprinosi neurološkim poremećajima kao što je Alchajmerova bolest. Heksokinaza, ()-zavisni enzim, katalizuje prvi korak u ciklusu glikolize, kojim se glukoza razlaže uz oslobađanje energije. Inhibicija heksokinaze je posredovana vezivanjem aluminijuma za supstrat; ima 107 puta veći afinitet za () nego ().[234] Dok najveći deo glukoze podleže glikolizi, 15—20% se podvrgava heksozomonofosfatnom šantu. Jedan od ključnih enzima u ovom putu, glukoza-6-fosfat dehidrogenaza (), inhibira se posredstvom () (μ raspon).[234] Do toga dolazi usled direktne interakcije sa enzimom; ()-vezani enzim podleže konformacionoj promeni do nasumičnije uređene strukture (sudeći po nalazima cirkularne dihroizne spektroskopije).
Trenutno se organski acetilholinesterazni inhibitori koriste u tretmanu Alchajmerove bolesti; međutim, porfirini cinka i gvožđa isto tako inhibiraju acetilholinesterazu.[235] Broj i pozicije fluorinskih grupa na porfirinskom prstenu imaju ogroman efekat na inhibitornu aktivnost.[247]
S obzirom da postoji evidencija da dolazi do akumulacije metalnih jona u nekoliko bolesti centralnog nervnog sistema (), od znatnog interesa je da se utvrdi da li ova akumulacija ima ulogu u patogenezi bolesti, a ako je to slučaj i da se odredi biohemijska priroda njihovog učešća. U jednoj nedavnoj studiji, veliki broj lizozomalnih i citoplazmičnih proteinaza koje su prisutne u cerebralnom korteksu testiran je za inhibiciju metalnim jonima.[236] Utvrđeno je da milimolarne koncentracije 2+, 2+, 2+, 2+ i 2+ inhibiraju sve testirane lizozomalne proteinaze. Ovi joni isto tako inhibiraju citoplazmične proteinaze u različitim merama a u zavisnosti od metalnog jona. Prolinska endonukleaza i leucilna aminopeptidaza se inhibiraju 50% ili više sa 2+ i 2+, redom. Alanil-, leucil- i tripeptidilaminopeptidaze su inhibitirane sa 0,05 2+. Piroglutamilna peptidaza se inhibira sa 0,05 2+, 2+, 2+, 2+ ili 2+. Alanil- i ripeptidilaminopeptidaze, prolinska endopeptidaza, te piroglutamil aminopeptidaza, inhibirane su u različim merama sa 2+ i 2+. 2+, 2+, 2+, 2+ i 3+ inhibiraju kalpain i u različitim merama pri koncentraciji 5 . Implikacije ovih nalaza o metalnim jonama su predment istraživanja.
Iz ovih radova sledi da je uloga metalnih jona u neurološkim bolestima kompleksna i raznolika. Metalni joni demonstriraju raznovrstan asortiman efekata, od kinetičkih do strukturnih. Kinetički efekti mogu da budu inhibitorni ili aktivirajući. Strukturni efekti mogu da podstaknu agregaciju ili otežaju vezivanje. Ovi efekti nagoveštavaju da metalni joni mogu da budu intimatno uključeni u proces enzimske regulacije. Da bi se sprovela in vivo ispitivanja bilo bi neophodno da se ostvare milimolarne koncentracije metala u tkivima, što je normalno slučaj pod fiziološkim uslovima. Drugim rečima, potrebno je praviti razliku između potencijalno regulatornih procesa i toksičnih efekata.
Artritisne primene
| Artritisne primene | |||
|---|---|---|---|
| Kompleks | Metal | Inhibirani enzim | |
| Auranofin, natrijum tiomalat | proteinska kinaza [248][249] | ||
| trimetilaminski karboksiborani | , , | elastaza, kolagenaza, lipoksigenaza, katepsin, ciklooksigenaza[250] | |
| jon | kalpain [251] | ||
| aminski karboksiboranei i njihovi estri | inozin monofosfat, de novo regulatorni enzimi u sintezi lipida[252] | ||
Jedinjenja zlata, kao što je auranofin, ekstenzivno su korišćena za tretman reumatoidnog artritisa, mada mehanizam njihovog dejstva još uvek nije utvrđen. Mnoge studije su demonstrirale inhibiciju lizozomalnih enzima[253][254] i proteinske kinaze , što može da objasni imunosupresivno dejstvo soli zlata.[248][249]
Kompleksi bakra[255][256] i bakarni kompleksi antiinflamatornih lekova[257] pokazali su se efektivnim kao antiinflamatorni agensi. Postoje indikacije da ovi kompleksi utiču na više enzimskih sistema, a moguće je i da sam bakar ima ulogu u patogenezi bolesti. Oboleli od artritisa imaju povišene prosečne serumske ili plazmene koncentracije bakra, što je u direktnoj korelaciji sa jačinom i aktivnošću bolesti.[255] Utvrđeno je da bakar inhibira glutation--transferazu, a umanjena aktivnost je simptomatična za hronični artritis. Poznato je da su brojni od bakra zavisni enzimi neophodni za oporavak od upale tkiva.
Enzimi proteolitičkog puta su frekventno implicirani u destrukciju hrskavice obolelih od artritisa. Oni su metaloproteinaze, serinske proteaze i cisteinske proteaze, generalno prisutni u vezanom obliku sa prirodnim inhibitorima. Sistem kalpain-kalpastatina je značajan jer je kalpastatin (inhibitor kalpaina) autoantigen kod skoro 50% reumatoidnih artritisnih pacijenata i postoji evidencija da je kalpain prekomerno izražen kod artritisnih bolesnika.[258] Kalpain je ()-zavisna cisteinska proteaza koja se javlja u vidu dve izoforme: 1. kalpain , za čiju aktivaciju se neophodne niske koncentracije kalcijuma, i 2. kalpain II, kome su potrebne visoke koncentracije. Joni aluminijuma različito utiču na ove dve izoforme u kalcijum-zavisnom maniru.[259] U prisustvu milimolarne koncentracije kalcijuma, inhibira kalpain u koncentraciono zavisnom maniru, dok je kalpain maksimalno inhibiran unutar uskog koncentracionog opsega (0,1—0,5 ). U odsustvu kalcijuma, aluminijum aktivira kalpain (koji je inače neaktivan).
Imajući u vidu efektivnost borana kao serinskoproteaznih inhibitora, ali i ulogu proteaza u artritisu, nije iznenađujuće da je utvrđeno da su brojni aminski karboksiborani antiinflamatorni agensi. Kompleksi bakra i gvožđa trimetilaminskih karboksiborana inhibiraju aktivnost lizozomalnih i proteolitičkih enzima u makrofagama,[250] kao i neki od samih aminskih karboksiborana.[252] Među inhibiranim enzimima su neutralni katepsin, tripsin, elastaza, kolagenaze I i II, prostaglandinska sintaza, ciklooksigenaza (indukovana kod inflamatornog artritisa)[260] i 5'-lipoksigenaza. Svi su inhibirani pri mikromolarnim koncentracijama.[250] Takođe je utvrđeno da aminski karboksiborani imaju mnoštvo drugih efekata, uključujući inhibiciju regulatornih enzima koji učestvuju u de novo sintezi lipida, DNK i RNK. Putem in vivo eksperimenata je isto tako utvrđeno da aminski karboksiborani vrše različite uticaje, uključujući snižavanje serumskog holesterola, blokiranje kalcijumske resorpcije (što je problematično kod osteoporoze) i redukovanje inflamacija.[252] Dalja istraživanja su neophodna da bi se utvrdila specifičnost ovih agenasa i strukturna svojstva koja utiču na razna terapeutska svojstva. Artritis je dobar primer bolesti u kojoj su metalni kompleksi ekstenzivno korišćeni kao terapija iako mehanizam dejstva nije poznat.
Primena na infekcije
Viralne primene
| Viralne primene | |||
|---|---|---|---|
| Kompleks | Metal | Inhibirani enzim | |
| polioksovolframati | reverzna transkriptaza, RNK polimeraza, DNK polimeraza[261] | ||
| tiosemikarbazoni | reverzna transkriptaza virusa leukemije[262] | ||
| reverzna transkriptaza[263] | |||
| trifluoperazin | , , , , | reverzna transkriptaza virusa leukemije[264] | |
| streptonigrin | topoizomeraza, reverzna transkriptaza[142] | ||
| joni | , , , , , , | proteinaza[265] | |
| batokuproinska disulfonska kiselina | proteaza, integraza[266] | ||
| joni | proteaza[267] | ||
| joni | renin, proteaza[265] | ||
| inhibitorni helat | proteaza[268] | ||
| fenantrolin, neokuproin, batokuproinski kompleksi | integraza[269] | ||
| aromatični polihidroksilati | integraza, drugi enzimi kojima je potreban metal[270] | ||
| porfirini | , | hem oksigenaza[195] | |
Virusi koriste relativno mali broj, jedinstvenih enzima za održavanje svog životnog ciklusa, što čini te enzime atraktivnim metama za antivirusne lekove.[271] Na primer, genom virusa ljudske imunodeficijencije () kodira tri kritična enzima: 1. reverznu transkriptazu koja konvertuje infekcionu viralnu RNK u DNK, 2. integrazu koja umeće DNK u domaćinov genom, i 3. proteazu koja preseca virusne genske produkte do njihovih krajnjih formi.[272] Virusni enzimi su generalno u većoj meri konzervirani, a to je posebno slučaj sa njihovim aktivnim mestima u odnosu na pokrovne proteine, još jednu klasu metalekova; stoga su manje skloni razvoju mutacione otpornosti na lekove. Tokom poslednjih nekoliko dekada ogromni napori su uloženi u istraživanje načina sprečavanja propagacije virusa, a jedan od glavnih terapijskih ciljeva je bila reverzna transkriptaza.
Reverzna transkriptaza () prominentna je meta za inhibitore jer je distinktna u odnosu na normalne polimeraze ćelija domaćina i fizički odvojena od replikacione mašinerije domaćina (viralna transkriptaza je citoplazmatična, a ne jedrena). Reverzna transkriptaza je multifunkcionalni enzim. Ona deluje kao polimeraza koja formira plus i minus lance DNK i kao ribonukleaza H koja razlaže RNK porciju RNK-DNK hibrida.[273] Inhibicija može da bude usmerena na bilo koju od tih funkcija ili mesta vezivanja enzima, mada svi trenutno odobreni inhibitori utiču na polimeraznu funkciju.[274] Mnogi nukleozidni analozi i nenukleozidni inhibitori su razvijeni tokom poslednjih godina, ali relativno mali broj tih inhibitora su metalni kompleksi.
Polioksovolframati, a posebno serije silikovolframata iz keginske grupe, klasa su neorganskih jedinjenja za koje je pokazano da imaju antiviralno dejstvo.[261] Ova jedinjenja inhibiraju viralnu replikaciju u -om infektiranim ćelijama i ispoljavaju kompetitivnu i nekompetitivnu inhibiciju prečišćene ili poli(etilen glikolom) precipitirane reverzne transkriptaze. Inhibicija RNK-zavisne DNK polimerazne funkcije se ostvaruje na 3—6 puta nižoj koncentraciji nego za DNK-zavisnu DNK polimeraznu aktivnost. Testovi na drugim prečišćenim DNK polimerazama indiciraju da su silikovolframova jedinjenja najsenzitivnija protiv virusa leukemije miševa (50 = 0,0035 μ), manje efektivna protiv -1 (50 = 3 μ) i relativno neefektivna protiv ljudske DNK polimeraze 1 (50 = 43 μ). Mada je DNK polimeraza α donekle senzitivnija na inhibiciju od -1 , testovi u kulturi su pokazali antiviralnu aktivnost bez citotoksičnosti; koncentracije neophodne za proizvodnju citotoksičnosti su nekoliko redova veličine više od koncentracije neophodne za eliminaciju virusa. Mada specifičnost tih jedinjenja protiv nije ustanovljena i tačno mesto inhibicije na nije poznato, njihovo antiviralno dejstvo u kulturama podstiče dalja istraživanja.
Tiosemikarbazoni su već duže vreme poznati kao antiviralni agensi. Diorganokalaj() kompleksi piridil tiosemikarbazona su nedavno okarakterisani i utvrđeno je da inhibiraju .[262] Kompleksi bakra i kobalta istog liganda () takođe su ispitani.[275] ()2() i ()2() kompleksi su najefektivniji protiv , ali nisu testirani na drugim polimerazama da bi se utvrdila specifičnost inhibicije. Stoga se na bazi ovih studija antiviralno dejstvo jedinjenja ne može isključivo pripisati njihovoj inhibiciji . Takođe je poznato da tiosemikarbazoni inhibiraju ribonukleotidne reduktaze, RNK-zavisnu DNK polimerazu, te dihidrofolatnu reduktazu.[137]
Trifluoperazini (), derivati psihoterapeutskog leka fenotiazina, takođe imaju potvrđeno antiviralno dejstvo. Metalni kompleksi su testirani na virusa leukemije miševa, i ustanovljeno je da metali pospešuju inhibiciju u redosledu () > () > () > () > () > slobodni ligand.[264] Ovi kompleksi su efektivni protiv reverznih transkriptaza više retrovirusa. Streptonigrin je antibiotik koji je potencijalno mogao da deluje kao antitumorski agens za razne ljudske kancere; međutim, toksične nuspojave tretmana streptonigrinom su dovele do prekida kliničkih ispitivanja. Streptonigrin takođe selektivno inhibira ptičjeg mijeloblastoznog virusa () i bez inhibiranja ćelijskih polimeraza.[142] Mehanizam dejstva streptonigrina je ispitan nakon prekida kliničkih ispitivanja. Pregled rezultata tih studija, uključujući detaljnu strukturnu karakterizaciju nekoliko metalnih kompleksa leka, pokazao je da je metalna jompleksacija ključna za biološku aktivnost leka.[142] Međutim, precizni mehanizam njegovog terapeutskog efekta je još uvek nepoznat.
Primena metal-helirajućih derivata , a [2',5'---(tert-butildimetilsilil)-β-dribofuranozil]-3'-spiro-5-(4-amino-1,2-oksatiol-2,2-dioksid) nukleozidnog derivata timina predstavlja jedan drugačiji pristup poboljšanju inhibicije reverzne transkriptaze.[276] Roditeljsko jedinjenje, , vezuje se za alosterno mesto locirano pored katalitičkog mesta.[263] Ovo mesto vezivanja inhibitora formira interakcije sa obližnjim 2+ mestom vezivanja.[277] Nova klasa jedinjenja je dizajnirana sa vezanim inhibitorom, , za metalnu helirajuću grupu, jer se smatralo da će formirati bidentatni inhibitor sa većim afinitetom za enzim. Nekoliko derivata je bilo sintetisano, a za one sa kratkim alkilnim lancima je utvrđeno da su znatno efektivniji antiviralni agensi. Nekoliko derivata koji su jednako aktivni kao roditeljsko jedinjenje ima znatno manju toksičnost (10 puta manje koncentracije rezultuju sa 50% povećanja ćelijske održivosti). Ova klasa jedinjenja je primer inhibitora koji ne sadrže metal i inhibiraju putem formiranja metalnog kompleksa.
-1 proteaza je aspartilna proteaza koja formira zrele proteine iz produkata gena (grupno specifičnih gena) i gena (DNK polimeraze). Otpornost na proteazne inhibitore se teže ostvaruje kod virusa nego otpornost na inhibitore,[278] te su razvijeni mnogi peptidni inhibitori.[227] Utvrđeno je da brojni metalni joni deluju kao inhibitori -1 proteaze, a da su najefektivniji teški joni (3+, 22+, 3−/43−, 22, 2+), kao i da su oni uglavnom tetraedralno koordinirani.[265] Metali nekompetitivno inhibiraju enzim, tako što simultano sa supstratom zauzimaju aktivno mesto. Smatra se da se metali koordiniraju sa karboksilatnim bočnim lancima aktivnih ostataka 25 i 125, mada to nije definitivno potvrđeno. Moguće je da će ove obzervacije podstaći dizajn inhibitora -1 proteaza koji će sadržati metale koji se vezuju za enzim jonskim ili kovalentnim vezama, te da će stoga biti znatno jače vezani od peptidnih inhibitora.
Goreopisana studija metalnih jona je naizgled u konfliktu sa rezultatima jedne ranije studije koja je pokazala da joni cinka i srebra nekompetitivno — a joni bakra kompetitivno inhibiraju proteaze i renin iz -1.[265] Ranija studija je sprovedena na rekombinantnoj proteazi izolovanoj iz , dok je kasnija studija koristila sintetičku 2 sekvencu proteaze, u kojoj je aminobutirna kiselina zamenjena cisteinskim ostatkom.[183][227][279][280] Nije sasvim jasno u kojoj meri sintetički enzim oponaša prirodni enzim. Isto tako, studije su izvedene na različitim vrednostima, ranije studije na neutralnom a kasnije na 5. Ranije studije su zapravo pokazale da je inhibicija cinkom u velikoj meri zavisna od . Procenjuje se dolazi do nadmetanja cinka sa protonom za grupu sa = 7,0. Molekularne dinamičke simulacije izvedene na proteazi u prisustvu cinka indiciraju da se joni cinka vezuju za katalitički aktivno mesto na ostacima 25 i 25' bez poremećaja strukture enzima.[267]
Utvrđeno je da je 2 efektivan inhibitor proteaze, ali ne i mutirane proteaze u kojoj su alanini supstituisani cisteinima.[281] Mutirana proteaza može inhibirati 2 u prisustvu bakarnih helatora. Utvrđeno je da je batokuproin sulfonska kiselina (), (), kompetitivni inhibitor proteaze.[266] Sama ne inhibira enzim, niti inhibicija kompleksa može da bude blokirana pomoću . Iz ovoga sledi da je metalni kompleks aktivni inhibitor, a ne slobodni ligand niti slobodni metal. Kompleks isto tako inhibira mutiranu proteazu kojoj nedostaju cisteni. Drugi bakarni helati inhibraju -1 proteazu. Utvrđeno je da je diakva[bis(2-piridilkarbonil)amido]bakar() nitrat dihidrat kompetitivni inhibitor proteaze.[268] Ova studija takođe sugeriše da su molekuli vode u aktivnom mestu koji su prisutni između 25 i 125 važni za strukturu enzima. Ova činjenica može da utiče na dizajn inhibitora koji ne sadrže hidroksilne supstituente.
Utvrđeno je da bakarni kompleksi inhibiraju integrazu.[269] Dolazi do nekompetitivne inhibicije mehanizmom koji se razlikuje od jednostavnog blokiranja vezivanja supstrata ili vezivanja DNK. Inhibicija mutanata - i -terminalnog brisanja ovim kompleksima ukazuje na činjenicu da se ovi kompleksi vezuju za sržni region integraze. Selektivnost kompleksa za integraze do sada nije demonstrirana. Integraze sadrže motive cinkovog prsta u blizini -terminusa i konzervirani motiv aspartatnih i glutamatnih ostataka koji verovatno učestvuju u DNK vezivanju ili presecanju.[272] Oni takođe mogu da predstavljaju mesta potencijalnih interakcija sa metalnim kompleksima. Za veliki broj antrahinona i srodnih polihidroksilisanih fenolnih molekula je pokazano da inhibiraju integraze pri nanomolarnim koncentracijama.[270] Ova jedinjenja reaguju i sa drugim enzimima za čije dejstvo su neophodni metali (reverzne transkriptaze mišjeg leukemijskog virusa, , i restrikcioni enzimi i ), ali ne i sa enzimima kojima nisu potrebni metali. Iz ove činjenice proizilazi da metali učestvuju u inhibitornom mehanizmu. Za neka od testiranih jedinjenja je poznato da su metalni helatori. inhibicija je efikasnija u prisustvu 2+ nego 2+ (do 26 puta manje vrednosti 50 u zavisnosti od jedinjenja). Ovaj efekat je uočen i kod integraze.[282] Poznato je da katalitički domen integraze vezuje metale, a inhibicija može da obuhvati formiranje tercijarnog kompleksa inhibitora, metala i enzima; međutim, to ovo još uvek nije dokazano.
Opisani inhibitori viralnih enzima uglavnom nemaju ekskluzivnu specifičnost. Izuzev derivata , inhibitori ove klase nisu dizajnirani za interakciju sa specifičnim mestima. Mnogi inhibitori su identifikovani skriningom prvo za inhibiciju viralne replikacije a zatim za aktivnost na prečišćenim enzimima.
Neviralne primene
- Bakterije, glijvice i paraziti
| Antimikrobne primene | |||
|---|---|---|---|
| Kompleks | Metal | Inhibirani enzim | |
| 1-amino-3-(2-piridil)izohinolin, joni | oksidaza, laktatna dehidrogenaza[283] | ||
| sulfadiazin | fosfomanozna izomeraza[284] | ||
| trovalentna jedinjenja arsena | tripanotionska reduktaza, glutationska reduktaza[285] | ||
| , | kiselinska fosfataza[286] | ||
| šećerni kompleksi | hitinaza[287] | ||
| trovalentna jedinjenja amonijaka | fosfofruktokinaza[288] | ||
| pentostam | klinički demo[289] | ||
| tiosemikarbazoni | dihidrofolatna reduktaza[137] | ||
| jon | ektokiselinska fosfataza[290] | ||
| titanil sulfati | serinske proteaze[225] | ||
Neke od najranijih primena neorganskih jedinjenja u medicini su bile u vidu antiseptika i antimikrobnih agenasa.[205][226][291] Zapravo, organoarsenična jedinjenja su bila prva jedinjenja koja su uspešno primenjena za tretman sifilisa (ona su kasnije zamenjena penicilinom), a korišćena su kao aditivi stočne hrane za sprečavanje bakterijskih i parazitskih infekcija.[226] Sulfanilamidi su velika klasa jedinjenja koja ispoljava antibakterijsku efektivnost, a poznato je i nekoliko metalnih jona koji imaju antimikrobno dejstvo.[292] Organometalna jedinjenja se rutinski testiraju za antimikrobne efekte radi identifikacije mogućih lekova. Osim agenasa koji inhibiraju enzime, postoji mnoštvo agenasa čiji mehanizam nije poznat.[293][294][295][296][279]
Jedna nedavna studija se bavila ispitivanjem inhibicije serinskih proteaza kod bakterija i gljivica radi razvoja antimikrobinih agenasa. Skrining velikog broja metalnih jona na tripsinu iz raznih izvora (prečišćenih i u bakterijskim lizatima) i goveđem pankreasnom himotripsininu pokazao je da samo () u obliku titanilnog sulfata inhibira tripsin, dok drugi metali ili uvećavaju aktivnost (2+, 2+) ili nemaju efekta.[225] Ova inhibicija je kompetitivna, što znači da se inhibitor vezuje za aktivno mesto. Inhibicija himotripsina nije uočena, te je predloženo da se () vezuje za -198 u supstratnom mestu vezivanja za ostatak koji nije prisutan kod himotripsina. Utvrđeno je da su titanilni alkoholni kompleksi manje inhibitorni (25% inhibitorne aktivnosti) nego sulfati. Petokoordinatna geometrija () bila je razmatrana kao moguće objašnjenje uočene aktivnosti () protiv bakterija u odnosu na druge metalne jone i geometrije.
Trivalentni arsenični lekovi, kao što je melarzoprol, još uvek se rutinski koriste u tretmanu tripanozomom posredovanih bolesti, kao što je afrička bolest spavanja. Mehanizam njihovog dejstva nije ispitan, mada se smatra da je posledica interakcije sa proteinskim ditiolima. Poznato je da trivalentna jedinjenja arsena formiraju stabilne adukte sa ditiol tripanotionom, te da se ti adukti efektivnije nadmeću za aktivno mesto tripanotion reduktaze.[297] Tripanotion, koji je analogan glutationu kod sisara, jedinstven je za tripanozome. Jedna nedavna studija je ispitala uticaj nekoliko jedinjenja arsenika na tripanotionsku i glutationsku reduktazu, dva enzima koja sadrže katalitičke sulfidrilne grupe.[285] Inhibicija oba enzima je znatno senzitivnija u prisustvu NADPH, što je indikacija da cisteinski sulfidrili moraju da budu redukovani da bi formirali interakcije sa lekovima. Tripanotionska reduktaza je senzitivnija na inhibiciju od glutationske reduktaze. Inhibiciju obustavlja dihidrotripanotion. Iako jedinjenja arsena inhibiraju enzim, pošto je dihidrotripanotion in vivo dostupan u znatno višim koncentracijama od tripanotionske reduktaze, malo je verovatno da bi inhibicija ovog enzima mogla da ima terapeutski učinak na tripanozomijazu.
Antimonijali su dugo korišćeni kao antiparazitici,[226][291] i još uvek se koriste u tretmanu sluzokožne lišmanijaze.[289] Niz drugih metala se ispituje za njihovu aktivnost protiv lišmanijaze. Postoje indikacije da kiselinske fosfataze () doprinose patogenosti tripanosoma . Te fosfataze mogu da inhibiraju brojni prelazni metali i njihovi kompleksi, kao što su arsenat i vanadat.[290] Studije u kojima je korišćena tartratno senzitivna kiselinska fosfataza iz ljudskog semenog fluida i tartratno rezistentna fosfataza iz protozoe demonstrirale su da heteropolianjonski kompleksi molibdena (sa , , , , ) selektivno inhibiraju ove enzime.[286] Testirane su četiri klase kompleksa, koje sadrže 4, 6—8, 12 ili 18 atoma . Selektivnost je procenjena na osnovu inhibicije pomenutih enzima i odsustva inhibicije iz ljudske slezine. β-glukuronidaze i α-manozidaze iz slezine su takođe ispoljile malo ili nimalo inhibicije usled dejstva molibdenat-heteropolianjona. Studije unakrsnog nadmetanja između ovih inhibitora indiciraju da se neki od kompleksa vezuju za aktivno mesto, dok se drugi vezuju za drugo mesto koje utiče na aktivno mesto. Na primer, vezivanje vanadata i jednog od kompleksa nije bilo uzajamno isključivo, a vanadat je pojačavao inhibiciju kompleksa.
Antimon se takođe primenjuje kao antišistozomijalni agens. Nedavnim istraživanjima je utvrđeno da razni antimonijali inhibiraju fosfofruktokinazu () iz metilja .[288] Opstanak šistozoma je zavisan od velike brzine glikolize, a je ključni enzim u glikolitičkom putu — sadrži 20 cisteina. Upoređivanjem šistozomalne i sisarske je utvrđeno da antimoniltartarat kalijum preferentno inhibira parazitov enzim. Mehanizam ove selektivnosti nije razjašnjen.
Metalni joni i metalni kompleksi su efektivni antifungalni agensi protiv patogenog kvasca . Kompleksi srebra inhibiraju fosfomanoznu izomerazu (), ključni enzim u biosintezi kvaščanih ćelijskih zidova, sa .[284] mutant kod koga je 150 zamenjen sa alaninom ponaša se na sličan način kao i prirodni enzim, ali ne biva inhibiran jedinjenjima srebra i 1000 puta je manje senzitivan na živu. Iz ovoga proizilazi da je 150 mesto interakcije inhibitora. Joni srebra inhibiraju sa 210 puta višom bimolekularnom konstantom brzine za ljudski enzim. Ova jedinjenja redukuju specifičnost za ljudski enzim do 1,3 : 1. I dok ih ovo ne kvalifikuje kao inhibitore koji su selektivni za parazite, može se pretpostaviti da je moguće razviti lek putem modifikacija organskih grupa. Kompleksi nikla inhibiraju hitinazu, koja takođe učestvuje u biohemiji ćelijskog zida kvasca-gljive .[287] Pomenuti kompleksi sadrže -glikozide izvedene iz aminošećera, koji inhibiraju u kompetitivnom maniru.
Mikoplazmi nedostaje čvrst ćelijski zid. Jonski bakar je efektivan inhibitor mikoplazične aktivnosti i pokazano je da inhibira enzime u glikolitičkom putu, oksidazu i laktatnu dehidrogenazu.[283] 2,2'-bipiridinski tip liganda olakšava transport bakra kroz mikoplazmičnu membranu, pa je antimikoplazmično dejstvo bakra znatno povećano u prisustvu ovih liganda — mada prisustvo liganda umanjuje inhibitorni efekat na prečišćenim, izolovanim enzimima. Ova opažanja potvrđuju da je jon bakra toksičan materijal, a da ligand samo služi kao prenosnik.
- Tretman čireva
Bizmutove soli su korišćene u terapiji čireva. Poznato je da one inhibiraju adenozintrifosfatazu iz želučane bakterije (koja učestvuje u razviću peptičnog čira),[299] kao i fekalnu sluzokožnu sulfatazu (čije je izražavanje povišeno kod ulceroznog kolitisa).[298]
Toksičnost primene
| Toksičnost primene | |||
|---|---|---|---|
| Kompleks | Metal | Inhibirani enzim | |
| ions | γ-aminolevulinska kiselina[300] | ||
| joni | heksokinaza[301] | ||
| joni | , , , , | heksokinaza[302] | |
| joni | glicerolna kinaza[303] | ||
| joni | , , | aza[304] | |
| joni | poli-(-riboza) polimeraza[305] | ||
| joni | piruvatna dehidrogenaza, DNK ligaza[306] | ||
| joni | metiltransferaza[307] | ||
| joni | metiltransferaza[308] | ||
| arsenoglutation | glutationska reduktaza[309] | ||
| 3-arsonopiruvat | Fosfoenolpiruvatna mutaza[310] | ||
| jon | DNK polimeraza[311] | ||
| jon | , | DNK ligaza[312] | |
| jon | O6-metilguanin-DNA metiltransferaya, DNK polimeraza β[313] | ||
| respiratorni enzimi[129] | |||
| joni | peroksidaza rena, superoksid dismutaza[280] | ||
| jon | aza[314] | ||
| jon | γ-aminolevulinatna dehidrataza[315] | ||
Velika količina rada je uložena da bi se odredio molekularni mehanizam metalne toksičnosti. Uzrok smrtnosti je kombinacija više faktora. Razumevanje puteva na koje metali utiču je prerekvizit za sprečavanje toksičnosti, te pruža uvid u potencijalne primene u kojima se toksičnost iskorišćava za proizvodnju korisnih efekata. Aluminijumska toksičnost indukuje anemiju, a smatra se da do ovoga dolazi usled perturbacije biosintetičkog puta hema.[300] Uočeno je da aluminijum inhibira brojne enzime in vitro, uključujući dehidratazu δ-aminolevulinske kiseline (aka porfobilinogenu sintazu),[300] heksokinaze,[301] glicerolne kinaze[303] i azu.[304] Mehanizam inhibicije se razlikuje od enzima do enzima. Dehidrataza δ aminolevulinske kiseline koja katalizuje drugi korak biosinteze hema je metaloprotein koji vezuje osam jona cinka. Aluminijum nekompetitivno inhibira ove enzime, iz čega sledi da se ne vezuje za aktivno mesto, te da se verovatno nadmeće sa nekim ili svim jonima cinka.[300] Jonski prečnik 3+ je sličan prečniku 2+ ili 3+, a moguće je da aluminijum inhibira 2+-zavisne enzime putem supstitucije za 2+ (na primer u heksokinazi),[303] mada ovo nije bilo uočeno u svim studijama.[301] Za glicerolne kinaze i heksokinaze je takođe postulirano da se aluminijum nadmeće sa supstratom u obliku aluminijum- helatnog kompleksa.[301][303] Kinetika inhibicije može da pomogne u određivanju prirode inhibicionog mesta, ali su strukturne studije neophodne za određivanje preciznog toka interakcije.
Druge studije su demonstrirale da 2+, 2+, 2+, 2+ i 2+ inhibiraju heksokinazu (u niskom μ opsegu).[302] 2+ i 2+ su mnogo efektivniji od drugih metala. Inhibicija pomoću 2+ dovodi do pratećeg sniženja nivoa redukovanog glutationa (). Preinkubacija uzorka sa zaštićuje enzim od 2+ inhibicije. Poznato je da formira -() komplekse, a zaštitni efekti kompleksa su verovatno posledica jednostavnog uklanjanja 2+ iz rastvora. Predloženi su brojni modeli za relaciju između heksokinaze, i toksičnosti teških metala in vivo.
Postoje indikacije da je arsenična toksičnost redoks zavisna, tako da je pentavalentni () znatno manje toksičan od trivalentne forme elementa, ().[309][307] Arsenik je karcinogen, mada direktno ne oštećuje DNK. Najprominentnija hipoteza za njegov mehanizam delovanja je inhibicija enzima putem vezivanja za sulfhidrile, te je znatan broj studija bio usredsređen na ispitivanje dejstva arsenika na enzime popravke i ligacije DNK. Utvrđeno je da () inhibira enzim poli-(-riboza) polimerazu, koji sadrži dva vicinalna ditiola koji posreduju vezivanje enzima za prekide DNK lanaca.[305] Mehanizam inhibicije još uvek nije utvrđen. Piruvatnu dehidrogenazu inhibira () pri mikromolarnim koncentracijama, ali ne i (). Nekoliko drugih enzima za DNK popravku je testirano i utvrđeno je da na njih () nema uticaja, mada neki sadrže grupe od presudnog značaja za svoju funkciju.[306] Arsenit može da inhibira ligaznu aktivnost u kultivisanim ćelijama ali ne i u nuklearnim ekstraktima iz tih ćelija, iz čega sledi da inhibicija ligaza nije direktna već se javlja na nekom drugom nivou popravke.[306] Spektroskopske studije () inhibicije metiltransferaze (enzima koji učestvuje u modifikaciji i popravci nepodudarnih DNK segmenata) indiciraju da se () vezuje za 223, čime indukuje efekat teškog atoma () na obližnjem ostatku. Ovo je potvrđeno opservacijom da se ne javlja kod mutanta sa 223 zamenjenim 223 ostatkom.[307][308] Pojava je zasnovana na nalazima crvenog pomaka fosforescentnog spektra i znatnog skraćenja životnog veka tripletnog stanja ()-perturbiranog triptofana. Ova interakcija ne utiče na enzimsku aktivnost, tako da je inhibicija koja je uočena u prisustvu viška arsenita verovatno posledica vezivanja za druge cistenske ostatke enzima.
Inhibicija glutationske reduktaze sa () konzistentna je sa oksidacijom tiolnih grupa u aktivnom mestu enzima.[309] Arsen formira arsenoglutationske komplekse sa glutationom, i oni deluju kao inhibitori mešovitog tipa na glutationskoj reduktazi. Enzimi koji deluju na forsfornim jedinjenjima često prepoznaju arsenske analoge, npr. adenilatna ciklaza i RNK polimeraza. Pokazano je da 3-arsonopiruvat kompetitivno inhibira fosfoenolpiruvatnu () mutazu sa = 27 μ.[310] mutaza je glavni enzim u biosintetičkom putu formiranja veza. Nikl je poput arsena genotoksičan karcinogen, mada precizni mehanizam toksičnosti nije poznat. () služi kao slaba zamena za () u nekim polimerazama, dok druge polimeraze bivaju jako inhibirane.[311] Efekat jona nikla na inkorporaciju nukleotida, procesivnost i misinkorporaciju proučavan je kod sedam različitih polimeraza; izveden je zaključak da je njegov primarni efekat inhibicija (mikromolarni opseg). Međutim, ovo zavisi od brojnih faktora čiji značaj varira od enzima do enzima. Dejstvo nikla je kompleksno, a precizni mehanizam ometanja polimerazne funkcije nije ustanovljen. Inhibicija replikacije i popravke DNK povezana je sa mutagenošću i karcinogenošću metalnih jona.[313] Uočeno je da () inhibira azu, koja učestvuje u popravci 8-okso- oštećenja na DNK (milimolarni ).[314] Ćelije izložene oksidativnom stresu formiraju 8-okso-; prisustvo nukleotida povišava mutacionu frekvenciju u transverzijama usled 8-okso- nesparivanja. Inhibicija ()-zavisnog enzima popravke može da dovede do povišene mutageneze. Studije molekulskim modelovanjem ukazuju da se () ne vezuje za mesto vezivanja (), nego da indukuje konformacione promene za koje je predviđeni uzrok vezivanje za histidinske ostatke.[314]
Uočeno je da cink i kadmijum takođe inhibiraju enzime DNK popravke.[313] Prečišćena DNK ligaza se inhibira sa 0,8 2 i 0,04 2.[312] Oba metala inhibiraju formiranje intermedijera, transferazno dejstvo i ligaciono dejstvo, a nemaju efekta na brzinu misligacije. Drugim rečima, inhibicija jedino utiče na enzimsku aktivnost dok se tačnost rada lizage ne menja. Ligazama je neophodan magnezijum kao kofaktor; je neophodan za sve tri koraka ligacione reakcije koja inhibira kadmijum i cink. Joni i mogu da deluju putem supstituisanja jona u mestu vezivanja metala.
Jedan od metala s lošom reputacijom u očima javnosti je olovo. Trovanje olovom zauzima istaknuto mesto u javnoj svesti zbog mnoštva incidenata uzrokovanih primenom olova na radnim mestima, kao i zbog trovanja dece olovnim bojama.[315] Jedan od mehanizama toksičnosti je inhibicija cink metaloenzima, odnosno γ-aminolevulinatne dehidrataze () koja je takođe nekompetitivno inhibirana aluminijumom. U slučaju olova, inhibicija se odvija putem supstitucije cinka olovom. Dva alela enzima su identifikovana kod ljudi (1 i 2) i oni kodiraju tri distinktna izozima. Testiranje velikog broja dece (izložene niskim nivoima olova u životnoj sredini) i radnika iz olovoprerađivačkih fabrika pokazala su da 2 pozitivni imaju povišene nivoe olova u krvi nakon sličnih izlaganja i da su znatno senzitivniji na trovanje olovom. Pretpostavlja se da 2 jače vezuje olovo.[315]
Metalna toksičnost može da bude rezultat oksidativnih reakcija. Vanadat učestvuje u mnoštvu takvih reakcija, a nedavno je objavljena studija u kojoj je izučavano njegovo dejstvo na antioksidantne enzime.[280] Četiri različita enzima su razmatrana i utvrđeno je da vanadat inhibira peroksidazu rena. Ovi nalazi doduše ne daju jasnu indikaciju o relaciji između antioksidantske enzimske inhibicije i toksičnosti.
Znatan deo literature se bavi jednim drugim mehanizmom inhibicije enzimske aktivnosti metalnim jonima: redukcijom količine enzima usled inhibiranja transkripcije gena koji kodiraju enzim.[318][319] Najvećim delom, rezultati ispitivanja naglašavaju da je toksičnost uzrokovana metalnim jonima posledica inhibicije koja se javlja na mnogim nivoima u mnogim sistemima, te da je malo verovatno da bilo koja pojedinačna promena može da bude samostalno odgovorna za toksične efekte.
Remove ads
- Analog prelaznog stanja
- Antimetabolit
- Farmakofor
- Inhibicija enzimskih reakcija
- Proteomika bazirana na aktivnosti — grana proteomike koja koristi kovalentne inhibitore enzima kao indikatore pri izučavanju enzimske aktivnosti
Wikiwand in your browser!
Seamless Wikipedia browsing. On steroids.
Every time you click a link to Wikipedia, Wiktionary or Wikiquote in your browser's search results, it will show the modern Wikiwand interface.
Wikiwand extension is a five stars, simple, with minimum permission required to keep your browsing private, safe and transparent.
Remove ads