From Wikipedia, the free encyclopedia
Dihdrofolat-reduktaza (DHFR) je enzim koji redukuje dihidrofolnu kiselinu na tetrahidrofolnu kiselinu, koristeći NADPH kao donor elektrona, koji se može pretvoriti u vrste tetrahidrofolata kofaktor koji se koristi u hemiji prenosa sa ugljikom1. Kod ljudi, enzim DHFR kodira gen DHFR.[5][6] Nalazi se ns poziciji regiona q11→q22 hromosoma 5.[7] Bakterijske vrste imaju različite DHFR enzime (zasnovane na njihovom obrascu vezanja diaminoheterocikličnih molekula), ali sisarski DHFR-i su vrlo slični.[8]
| Dihidrofolat-reduktaza | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Kristalna struktura dihidrofolat-reduktaze pileće jetre. PDB unos 8dfr} | |||||||||
| Identifikatori | |||||||||
| EC broj | 1.5.1.3 | ||||||||
| CAS broj | 9002-03-3 | ||||||||
| Baze podataka | |||||||||
| IntEnz | IntEnz pregled | ||||||||
| BRENDA | BRENDA unos | ||||||||
| ExPASy | NiceZyme pregled | ||||||||
| KEGG | KEGG unos | ||||||||
| MetaCyc | metabolički put | ||||||||
| PRIAM | profil | ||||||||
| PDB strukture | RCSB PDB PDBj PDBe PDBsum | ||||||||
| Ontologija gena | AmiGO / QuickGO | ||||||||
| |||||||||
| Dihidrofolat-reduktaza | |
|---|---|
| Identifikatori | |
| Simbol | DHFR_1 |
| R67 dihidrofolat-reduktaza | |
|---|---|
 Struktura visoke rezolucije dihidrofolat-reduktaze kodirane plazmidom iz E. coli. PDBe-2gqv | |
| Identifikatori | |
| Simbol | DHFR_2 |
Centralni osmolančani beta-nabrani list čini glavnu karakteristiku polipeptidnog savijanja DHFR-a.[9] Sedam od ovih lanaca je paralelno, a osmi protiče antiparalelno. Četiri alfa-heliksa povezuju uzastopne beta-lance.[10] Aminokiselinski ostaci 9 - 24 nazivaju se "Met20" ili "petlja 1" i, zajedno s ostalim petljama, dio su glavneog poddomena koji okružuje aktivno mjesto.[11] Aktivno mjesto nalazi se u polovini sekvence N-kraja, koja uključuje konzervirani Pro –x Trp dipeptid ; pokazalo se da je triptofan uključen u vezanje supstrata pomoću enzima.[12]
Dihidrofolat-reduktaza pretvara dihidrofolat u tetrahidrofolat, protonski šatl potreban za de novo sintezu purina, timidilnske kiseline i određenih aminokiselina . Dok je funkcionalni gen dihidrofolat reduktaze mapiran na hromosomu 5, na odvojenim hromosomima identificirani su višestruko obrađeni pseudogeni ili geni nalik onim za dihidrofolat-reduktazu, bez introna.[13]
Pronađen u svim organizmima, DHFR ima presudnu ulogu u regulaciji količine tetrahidrofolata u ćeliji. Tetrahidrofolat i njegovi derivati su neophodni za sintezu purina i timidilata, koji su važni za proliferaciju i rast ćelija.[14] DHFR ima središnju ulogu u sintezi prekursora nukleinskih kiselina, a pokazano je da je mutantnim ćelijama kojima potpuno nedostaje DHFR potrebna aminokiselina glicin i timidin za rast.[15] DHFR se također ispoljava kao enzim koji učestvuje u spašavanju tetrahidrobiopterina iz dihidrobiopterina.[16]
DHFR katalizira transfer hidrida iz NADPH u dihidrofolat sa pratećom protonacijom, da bi se dobio tetrahidrofolat. Na kraju se dihidrofolat redukuje u tetrahidrofolat, a NADPH se oksidira u NADP+. Visoka fleksibilnost Met20 i drugih petlji u blizini aktivnog mjesta ima ulogu u promociji oslobađanja proizvoda, tetrahidrofolata.[11]
.png)
Mehanizam ovog enzima je postepen i ustaljen. Konkretno, katalitska reakcija započinje s NADPH i supstratom, koji se veže na mjesto vezanja enzima, nakon čega slijedi protonacija i prijenos hidrida iz kofaktora NADPH u supstrat. Međutim, dva posljednja koraka ne odvijaju se istovremeno u istom prijelaznom stanju.[17][18] U studiji koja koristi računarski i eksperimentalni pristup, Liu i suradnici zaključuju da prijenosu hidrida prethodi korak protonacije.[19]
Pokazalo se da enzimski mehanizam DHFR ovisi o pH, posebno o koraku prijenosa hidrida, jer promjene pH imaju izuzetan uticaj na elektrostatiku aktivnog mjesta i stanje ionizacije njegovih ostataka. Kiselost ciljanog dušika na supstratu važna je za vezanje supstrata za mjesto vezanja enzima za koje se pokazalo da je hidrofobno, iako ima direktan kontakt s vodom.[17][20] Asp27 je jedini nabijeni hidrofilni ostatak na mjestu vezanja, a neutralizacija punjenja na Asp27 može promijeniti pKa enzima. Asp27 ima kritičnu ulogu u katalitskom mehanizmu, pomažući protoniranje supstrata i ograničavajući supstrat u konformaciji povoljnoj za prijenos hidrida. Pokazalo se da je korak protonacije povezan s tautomerizacijom enola, iako se ova konverzija ne smatra povoljnom za doniranje protona. Dokazano je da je molekula vode uključena u korak protoniranja.[21][22][23] Ulazak molekula vode u aktivno mjesto enzima olakšan je pomoću petlje Met20.[24]
Katalitski ciklus reakcije pomoću DHFR uključuje pet važnih međuprodukata: holoenzim (E: NADPH), Michaelisov kompleks (E: NADPH: DHF), trostruki kompleks proizvoda ((E:NADP+:THF)), tetrahidrofolatni binarni kompleks (E:THF) i THF‚NADPH kompleks (E:NADPH:THF). Korak disocijacije proizvoda (THF) od E: NADPH: THF do E: NADPH je korak koji određuje stopu tokom stabilnog stanja prometa.[25]
U katalitskom mehanizmu DHFR-a, ključne su konformacijske promjene.[26] Petlja Met20 DHFR-a može otvoriti, zatvoriti ili začepiti aktivno mjesto.[17][22] U skladu s tim, tri različite konformacije klasificirane kao otvorena, zatvorena i začepljena stanja, dodjeljuju se Met20. Pored toga, definirana je i dodatna iskrivljena konformacija Met20 zbog njegovih nejasnih rezultata karakterizacije. Petlja Met20 uočena je u svojoj začepljenoj konformaciji u tri međuprodukta koji ligirauju proizvod, pri čemu je nikotinamidni prsten zatvoren iz aktivnog mjesta. Ova konformacijska značajka objašnjava činjenicu da se zamjena NADP+NADPH dešava prije disocijacije proizvoda. Dakle, sljedeći krug reakcije može se dogoditi nakon vezanja supstrata.
Zbog svoje jedinstvene strukture i katalitskih karakteristika, R67 DHFR je široko proučavan. R67 DHFR je DHFR kodiran R-plazmidom tipa II, bez genetičke i strukturne veze sa hromosomskim DHFR E. coli. To je homotetramer koji ima 222 simetrije sa jednom aktivnom porom, koja je izložena rastvaraču [nul].[27] Ova simetrija aktivnog mjesta rezultira različitim načinom vezanja enzima: može se vezati s dvije molekule dihidrofolata (DHF), s pozitivnom kooperativnošću ili dvije molekule NADPH s negativnom kooperativnošću ili jednim supstratom plus jedan, ali samo ovaj drugi ima katalitsku aktivnost.[28] U usporedbi s hromosomskim DHFR E. coli, on ima veći Km u vezanju dihidrofolata (DHF) i NADPH. Mnogo niža katalitska kinetika pokazuje da je prijenos hidrida korak određivanja brzine, a ne oslobađanje proizvoda (THF).[29]
U strukturi R67 DHFR, homotetramer stvara pore aktivnog mjesta. U katalitskom procesu DHF i NADPH ulaze u pore iz suprotnog položaja. Interakcija slaganja π-π između NADPH-ovog nikotinamidnog prstena i DHF-ovog pteridinskog prstena čvrsto povezuje dva reaktanta na aktivnom mjestu. Međutim, nakon vezanja, uočena je fleksibilnost repa p-aminobenzoilglutamata DHF, što može pospješiti stvaranje prijelaznog stanja.[30]
Nedostatak dihidrofolat reduktaze povezan je sa megaloblastnom anemijom. Liječenje se vrši reduciranim oblicima folne kiseline. Budući da je tetrahidrofolat, proizvod ove reakcije, aktivni oblik folata kod ljudi, inhibicija DHFR-a može prouzrokovati funkcionalni nedostatak folata. DHFR je atraktivna farmaceutska meta za inhibiciju, zbog svoje ključne uloge u sintezi prekursora DNK. Trimetoprim, antibiotik, inhibira bakterijski DHFR, dok metotreksat, hemoterapijsko sredstvo, inhibira DHFR sisara. Međutim, rezistencija razvila se protiv nekih lijekova, kao rezultat mutacijskih promjena u samom DHFR-u.[31]
DHFR mutacije uzrokuju rijetku autosomno recesivnu urođenu grešku metabolizma folata, koja rezultira megaloblastičnom anemijom, pancitopenijom i ozbiljnom nedostatkom cerebralnog folata, što se može ispraviti dodatkom folinske kiseline.[32][33]
Budući da je folat potreban za brzo dijeljenje ćelija da bi se stvorio timin, ovaj efekt može se koristiti kao terapeutsku prednost.
DHFR može biti usmjeren u liječenju karcinoma i kao potencijalna meta protiv bakterijskih infekcija. DHFR je odgovoran za nivoe tetrahidrofolata u ćeliji, a inhibicija DHFR može ograničiti rast i proliferaciju ćelija karakterističnih za rak i bakterijske infekcije. Metotreksat, kompetitivni inhibitor DHFR-a, jedan je takav lijek protiv raka koji inhibira DHFR.[34] Ostali lijekovi uključuju trimetoprim i pirimetamin. Ova tri se široko koriste kao antitumorska i antimikrobna sredstva.[35] Ostale klase spojeva koje ciljaju DHFR općenito, a posebno bakterijske DHFR, pripadaju klasama kao što su diaminopteridini, diaminotriazini, diaminopirolokinazolini, stilbeni, halkoni, deoksibenzoini, između ostalih.[36]
Trimetoprim je pokazao aktivnost protiv različitih Gram-pozitivnih bakterijskih patogena.[37] Međutim, rezistencija na trimetoprim i druge lijekove usmjerene na DHFR može nastati zbog različitih mehanizama koji ograničavaju uspjeh njihove terapijske upotrebe.[38][39][40] Otpor može nastati pojačavanjem DHFR gena, mutacijama u DHFR,[41][42] smanjenje uzimanja lijekova, između ostalog. Bez obzira na to, trimetoprim i sulfametoksazol u kombinaciji se već desetljećima koriste kao antibakterijsko sredstvo.
Folat je neophodan za rast ,[43] a put metabolizma folata je meta u razvoju tretmana za rak. DHFR je jedna od takvih meta. Pokazano je da režim fluorouracila, doksorubicin i metotreksata produžava preživljavanje kod pacijenata sa uznapredovalim karcinomom želuca.[44] Daljnje studije inhibitora DHFR mogu dovesti do više načina liječenja raka.
Bakterijama je također potreban DHFR za rast i razmnožavanje, pa su stoga inhibitori selektivni za bakterijski DHFR našli primjenu kao antibakterijska sredstva.
Klase malih molekula koje se koriste kao inhibitori dihidrofolat-reduktaze uključuju diaminokinazolin i diaminopirolokvinazolin,[45] diaminopirimidin, diaminopteridin i diaminotriazin.[46]
Dihidrofolat-reduktaza iz Bacillus anthracis (BaDHFR) potvrđena je meta u liječenju zarazne bolesti, antraksa. BaDHFR je manje osjetljiv na analoge trimetoprima nego dihidrofolat-reduktaza drugih vrsta kao što su Escherichia coli, Staphylococcus aureus i Streptococcus pneumoniae. Strukturno poravnanje dihidrofolat-reduktaze iz sve četiri vrste pokazuje da samo BaDHFR ima kombinaciju fenilalanina i tirozina na pozicijama 96, odnosno 102.
Otpornost BaDHFR na analoge trimetoprima, posljedica je ova dva ostatka (F96 i Y102), koji također daju poboljšanu kinetiku i katalitsku efikasnost.[47] Sadašnja istraživanja koriste aktivne mutante u BaDHFR za usmjeravanje optimizacije olova za nove inhibitore antifolata.
DHFR se koristi kao alat za otkrivanje interakcija protein-protein u testu komplementacije protein-fragmenta (PCA).
DHFR kojima nedostaju CHO ćelije najčešće su korištene ćelijske linije za proizvodnju rekombinantnih proteina. Te ćelije se transfektiraju plazmidom koji nosi gen dhfr i gen za rekombinantni protein u jednom ekspresijskom sistemu, a zatim se podvrgavaju selektivnim uslovima u nedostajanju timidinske podloge. Opstaju samo ćelije s egzogenim genom DHFR, zajedno sa genom od interesa.
Pokazalo se da je dihidrofolat-reduktaza u interakcijama sa GroEL[48] i Mdm2.[49]
Šablon:FluoropirimidinActivity WP1601
Seamless Wikipedia browsing. On steroids.
Every time you click a link to Wikipedia, Wiktionary or Wikiquote in your browser's search results, it will show the modern Wikiwand interface.
Wikiwand extension is a five stars, simple, with minimum permission required to keep your browsing private, safe and transparent.
