U živim organizmima, startni kodon koji pokreće sintezu proteina kodira ili metionin (eukarioti) ili formilmetionin (prokarioti). U E. coli (prokariot), enzim zvani formilmetionin-deformilaza može otcijepiti formilnu grupu, ostavljajući samo N-terminalni ostatak metionina. Za proteine s malim, nenabijenim pretposljednjim N-terminalnim ostacima, metionin-aminopeptidaza može razdvojiti ostatak metionina.[8]
Broj gena koji kodiraju metionin-aminopeptidazu varira između organizama. Kod E. coli postoji samo jedan poznati MetAP, za monomerni enzim od 29,333 Da, kodiran genom koji se sastoji od 264 kodona.[8]Nokaut ovog gena u E. coli dovodi do nesposobnosti ćelije.[9] Kod ljudi postoje dva gena koji kodiraju MetAP, MetAP1 i MetAP2. MetAP1 kodira enzim od 42 kDa, dok MetAP2 kodira enzim od 67 kDa. Kvaščev MetAP1 je 40% homologan sa MetAP E. coli; unutar S. cerevisiae, MetAP2 je 22% homologan sa sekvencom MetAP1; MetAP2 je visoko konzerviran između S. cerevisiae i ljudi.[10] Za razliku od prokariota, eukariotski sojevi S. cerevisiae kojima nedostaje gen za MetAP1 ili MetAP2 su održivi, ali pokazuju sporiji rast od kontrolnog soja koji eksprimira oba gena.
Slika 1: Struktura aktivne stranice MetAP2. Generirano korištenjem PDB:1BOA u PyMol. Kliknite da vidite rotirajuću strukturu
Aktivno mjesto
Aktivno mjesto MetAP2 ima strukturni motiv karakterističan za mnoge metaloenzime—uključujući protein nosač dikisika, hemeritrin; dijedarni ne-hemgvožđeve proteine, ribonukleotid-reduktaza, leucin-aminopeptidaza, ureaza, arginaza, nekoliko fosfataza i fosfoesteraza—što uključuje dva premošćavajuća karboksilatliganda i premošćavajuću vodu ili hidroksidniligand.[8][11][12][13][14][15][16] Konkretno, u ljudskom MetAP2 (PDB: 1BOA), jedan od katalitskih metalnih iona vezan je za His331, Glu364, Glu459, Asp263 i premošćavajuću vodu ili hidroksid, dok je drugi metalni ion vezan za Asp251 (bidentat) , App262 (bidentat), Glu459, istu premošivačku vodu ili hidroksid. Ovdje su dva premošćavajuća karboksilata Asp262 i Glu459.
Dimetalni centar
Identitet aktivnog mjestametalnogiona u fiziološkim uvjetima nije uspješno utvrđen i ostaje kontroverzno pitanje. MetAP2 pokazuje aktivnost u prisustvu iona Zn(II), Co(II), Mn(II) i Fe(II), a različiti autori tvrde da je bilo koji metalni ion fiziološki: neki u prisustvu gvožđa,[17] ostali kobalta,[18][19] ili magnezija,[20] a drugi u prisustvu cinka.[21] Ipak, većina kristalografa ima kristalizovan MetAP2 ili u prisustvu Zn(II) ili Co(II) (vidi PDB bazu podataka).
Slika 2: Dva predložena mehanizma reakcije za MetAP u E. coli. (A) Tetraedarski intermedijer stabiliziran Glu204 i metalnim centrom. (B) Tetraedarski intermedijer je stabilizovao His178 i metalni centar.[22]
Premosni vodeni ili hidroksidni ligand djeluje kao nukleofil tokom reakcije hidrolize, ali tačan mehanizam katalize još nije poznat.[14][23][24] Katalitski mehanizmi enzima hidrolaze uveliko zavise od identiteta mostovnog liganda,[25] što može biti izazovno odrediti zbog teškoća proučavanja atoma vodika putem kristalografije X-zraka.
Ostaci histidina prikazani u mehanizmu desno, H178 i H79, konzervirani su u svim MetAP-ovima (MetAP1 i MetAP2) sekvenciranim do danas, što sugerira da je njihovo prisustvo važno za katalitsku aktivnost.[26] Na osnovu rendgenskih kristalografskih podataka, predloženo je da histidin 79 (H79) pomaže u pozicioniranju ostatka metionina u aktivnom mjestu i prijenosu protona na novoizloženi N-terminalni amin.[27] Lowther et al. predložili su dva moguća mehanizma za MetAP2 u E. coli, prikazana desno.[28]
Metionin aminopeptidaza 2, član porodice dimetalohidrolaze, je citosolni metaloenzim koji katalizuje hidrolitsko uklanjanje N-terminalnih metioninskih ostataka iz nastalih proteina.[8][11][29]
peptid-metionin peptid + metionin.
MetAP2 se nalazi u svim organizmima i posebno je važan zbog svoje kritične uloge u obnavljanju tkiva i degradaciji proteina.[8] Nadalje, MetAP2 je od posebnog interesa jer enzim ima ključnu ulogu u angiogenezi, rastu novih krvnih sudova, koji je neophodan za napredovanje bolesti uključujući solidni tumorski karcinom i reumatoidni artritis.[23] MetAP2 je također meta dvije grupe prirodnih antiangiogenih proizvoda, ovalicin i fumagilin i njihovih analoga kao što je beloranib.[27][28][30][31]
Dok su prethodne studije pokazale da MetAP2 katalizira uklanjanje N-terminalnih ostataka metionina in vitro, funkcija ovog enzima in vivo može biti složenija. Naprimjer, postoji značajna korelacija između inhibicije enzimske aktivnosti MetAP2 i inhibicije rasta ćelija, što implicira enzim u proliferacijiendotelnih ćelija.[31] Iz tog razloga, MetAP2 izdvojen je kao potencijalna metu za inhibiciju angiogeneze. Štaviše, studije su pokazale da MetAP2 pročišćava i stupa u interakciju sa α podjedinicom eukariotskog inicijacionog faktora 2 (eIF2), proteina koji je neophodan za sintezu proteina in vivo.[32] Konkretno, MetAP2 štiti eIF-2α od inhibicije fosforilacije od enzima eIF-2α kinaze, inhibira RNK-zavisnu protein kinazu (PKR) kataliziranu fosforilaciju eIF-2 R-podjedinice, a također preokreće PKR- posredovanu inhibiciju sinteze proteina u intaktnim ćelijama.
Slika 3: Fumagilin (zeleni i crveni) vezan za aktivno mjesto ljudskog MetAP2 (višebojno, sa cijan, ljubičastom i ružičastom koja odgovara heliksimama, listovima i petljama), s prikazanim dimetalnim ionima (plavo).
Brojne studije impliciraju MetAP2 u angiogenezi.[15][31][33][34][35] Konkretno, pokazalo se da kovalentno vezivanje ovalicinskog ili fumagilinskog epoksidnog ostatka na aktivnom mjestu histidinskog ostatka MetAP2 inaktivira enzim, čime se inhibira angiogeneza. Međutim, način na koji MetAP2 reguliše angiogenezu tek treba da se utvrdi, tako da je potrebno dalje istraživanje, kako bi se potvrdilo da antiangiogena aktivnost direktno proizlazi iz inhibicije MetAP2. Ipak, kako rast i metastaze solidnih tumora u velikoj mjeri ovise o angiogenezi, fumagilin i njegovi analozi—uključujući TNP-470, kaplostatin i beloranib—kao i ovalicin predstavljaju potencijalne agense protiv raka.[34][35]
Štaviše, sposobnost MetAP2 da smanji vitalnost ćelija u prokariotskim i malim eukariotskim organizmima učinila ga je metom za antibakterijske agense.[31] Do sada se pokazalo da i fumagilin i TNP-470 imaju i antimalarijsko djelovanje i kod in vitro i in vivo primjene, i fumarranol, još jedan analog fumagilina, predstavlja obećavajuću prednost.[35]
METAP2 inhibitor beloranib (ZGN-433) pokazao je djelotvornost u smanjenju tjelesne težine kod izrazito gojaznih osoba.[36] MetAP2 inhibitors work by re-establishing balance to the ways the body metabolizes fat, leading to substantial loss of body weight. Development of beloranib was halted in 2016 after deaths during clinical trials.[37]
Pokazalo se da METAP2 ima interakcije sa protein-kinazom R.[38]
Li X, Chang YH (novembar 1996). "Evidence that the human homologue of a rat initiation factor-2 associated protein (p67) is a methionine aminopeptidase". Biochem Biophys Res Commun. 227 (1): 152–9. doi:10.1006/bbrc.1996.1482. PMID8858118.
Bennett B, Holz RC (1997). "EPR Studies on the Mono- and Dicobalt(II)-Substituted Forms of the Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica. Insight into the Catalytic Mechanism of Dinuclear Hydrolases". J. Am. Chem. Soc. 119 (8): 1923–1933. doi:10.1021/ja963021v.
Hagen KS, Lachicotte R, Kitaygorodskiy A (1993). "Supramolecular Control of Stepwise and Selective Carboxylate Ligand Substitution in Aqua-Carboxylato-Bridged Dimetal(II) Complexes". J. Am. Chem. Soc. 115 (26): 12617–12618. doi:10.1021/ja00079a064.
Brown DA, Errington W, Glass WK, Haase W, Kemp TJ, Nimir H, Ostrovsky SM, Werner R (novembar 2001). "Magnetic, spectroscopic, and structural studies of dicobalt hydroxamates and model hydrolases". Inorg Chem. 40 (23): 5962–71. doi:10.1021/ic0103345. PMID11681912.
Larrabee JA, Chyun SA, Volwiler AS (novembar 2008). "Magnetic circular dichroism study of a dicobalt(II) methionine aminopeptidase/fumagillin complex and dicobalt II-II and II-III model complexes". Inorg Chem. 47 (22): 10499–508. doi:10.1021/ic8011553. PMID18921993.
Wang J, Sheppard GS, Lou P, Kawai M, Park C, Egan DA, Schneider A, Bouska J, Lesniewski R, Henkin J (maj 2003). "Physiologically relevant metal cofactor for methionine aminopeptidase-2 is manganese". Biochemistry. 42 (17): 5035–42. doi:10.1021/bi020670c. PMID12718546.
Leopoldini M, Russo N, Toscano M (juni 2007). "Which one among Zn(II), Co(II), Mn(II), and Fe(II) is the most efficient ion for the methionine aminopeptidase catalyzed reaction?". J. Am. Chem. Soc. 129 (25): 7776–84. doi:10.1021/ja068168t. PMID17523636.
Lowther WT, Zhang Y, Sampson PB, Honek JF, Matthews BW (novembar 1999). "Insights into the mechanism of Escherichia coli methionine aminopeptidase from the structural analysis of reaction products and phosphorus-based transition-state analogues". Biochemistry. 38 (45): 14810–9. doi:10.1021/bi991711g. PMID10555963.
Schultz BE, Ye B, Li X, Chan SI (1997). "Electronic Paramagnetic Resonance and Magnetic Properties of Model Complexes for Binuclear Active Sites in Hydrolase Enzymes". Inorg. Chem. 36 (12): 2617–2622. doi:10.1021/ic960988r.
Korendovych IV, Kryatov SV, Reiff WM, Rybak-Akimova EV (novembar 2005). "Diiron(II) mu-aqua-mu-hydroxo model for non-heme iron sites in proteins". Inorg Chem. 44 (24): 8656–8. doi:10.1021/ic051739i. PMID16296818.
Gil J, Esteban M, Roth D (decembar 2000). "In vivo regulation of the dsRNA-dependent protein kinase PKR by the cellular glycoprotein p67". Biochemistry. 39 (51): 16016–25. doi:10.1021/bi001754t. PMID11123929.
Li X, Chang YH (februar 1995). "Molecular cloning of a human complementary DNA encoding an initiation factor 2-associated protein (p67)". Biochim. Biophys. Acta. 1260 (3): 333–6. doi:10.1016/0167-4781(94)00227-t. PMID7873610.
Ray MK, Chakraborty A, Datta B, Chattopadhyay A, Saha D, Bose A, Kinzy TG, Wu S, Hileman RE, Merrick WC (maj 1993). "Characteristics of the eukaryotic initiation factor 2 associated 67-kDa polypeptide". Biochemistry. 32 (19): 5151–9. doi:10.1021/bi00070a026. PMID8098621.
Datta B, Datta R, Mukherjee S, Zhang Z (1999). "Increased phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2alpha at the G2/M boundary in human osteosarcoma cells correlates with deglycosylation of p67 and a decreased rate of protein synthesis". Exp. Cell Res. 250 (1): 223–30. doi:10.1006/excr.1999.4508. PMID10388536.
Gil J, Esteban M, Roth D (2001). "In vivo regulation of the dsRNA-dependent protein kinase PKR by the cellular glycoprotein p67". Biochemistry. 39 (51): 16016–25. doi:10.1021/bi001754t. PMID11123929.
Datta R, Tammali R, Datta B (2003). "Negative regulation of the protection of eIF2alpha phosphorylation activity by a unique acidic domain present at the N-terminus of p67". Exp. Cell Res. 283 (2): 237–46. doi:10.1016/S0014-4827(02)00042-3. PMID12581743.
