Plastidová DNA

Plastidová DNA (pDNA) je súhrnné označenie pre DNA nachádzajúcu sa v plastidoch, čiže vo zvláštnych organelách niektorých eukaryotických buniek. Niekedy sa používa aj konkrétnejší termín chloroplastová DNA (cpDNA či ctDNA), ktorý označuje DNA len v chloroplastoch, v plastidoch s pretrvávajúcou fotosyntetickou funkciou. Plastidová DNA tvorí súčasť mimojadrovej dedičnosti, podobne ako mitochondriálna DNA.

Schéma chloroplastu, pod číslom 11 je chloroplastová DNA

1. vonkajšia membrána
2. Periplazmatický priestor
3. vnútorná membrána
4. stróma (vodný roztok)
5. lumen (dutina) tylakoidu
6. membrána tylakoidu

7. granum (mincovitý zhluk tylakoidov)
8. lamela, stromálny tylakoid
9. škrob
10. ribozóm
11. plastidová DNA
12. tukové kvapôčky

U všetkých plastidových DNA ide o pozostatok prokaryotického genómu (nukleoidu) sinice, ktorá bola kedysi v procese eukaryogenézy pohltená eukaryotickou bunkou.^[1] Niekedy vznikajú plastidy sekundárnou endosymbiózou, ktoré však obsahujú tiež genóm sinice. Zvláštnosťou u niektorých skupín je tzv. nukleomorf – zvyškový genóm iného eukaryota po sekundárnej endosymbiotickej udalosti.^[2] Veľkosť pDNA je veľmi rozmanitá. Redukované plastidové genómy sa nachádzajú najmä u druhov, ktoré stratili svoju fotosyntetickú funkciu.

Plastidy sú špeciálne organely, ktoré sú prítomné v niektorých eukaryotických bunkách, čiže v bunkách so zložitejšou štruktúrou a istou vnútornou hierarchiou. Pôvodnou funkciou plastidov je fotosyntéza, hoci poznáme aj plastidy neschopné fotosyntetizovať. Plastidy sú od zvyšku bunky oddelené niekoľkými membránami a tvoria tak samostatný „kompartment“. Už to, že navyše obsahujú vlastný genóm – teda plastidovú DNA – naznačuje, že plastidy sú do určitej miery nezávislou jednotkou. Preto sa označujú ako semiautonómne organely. Skutočnosť, že sa v plastide nachádza DNA, je pre vedcov veľmi zaujímavá. DNA, čiže deoxyribonukleová kyselina, je totiž prítomná vo všetkých živých organizmoch, kde slúži ako genetický materiál, v ktorom sú vo forme genetického kódu zapísané návody na výrobu všetkých bielkovín v bunke. Skutočnosť, že aj plastidy majú vlastný genóm, hoci nie sú samostatné organizmy, je teda zdanlivo paradoxná. Mnohé štúdie však ukázali, že plastid je zrejme potomkom siníc,^[3][4] samostatne žijúcich fotosyntetizujúcich organizmov, ktoré sa kedysi dostali do eukaryotickej bunky a udomácnili sa v nej. Genóm plastidov má s genómom siníc veľa spoločných rysov.

Výskum a jeho história

V riase Chlamydomonas bola prvýkrát dokázaná prítomnosť plastidovej DNA
(10 000×, rastrovací elektrónový mikroskop)

Úvahy o existencii mimojadrovej dedičnosti v plastidoch sa objavovali už v päťdesiatych rokoch dvadsiateho storočia, ale pokusy o izoláciu DNA boli neúspešné. Úspešne dokázali existenciu vlákien plastidovej DNA až v roku 1962 Hans Rise a Walter Plaut z University of Wisconsin v ich štúdii Ultrastructure of DNA-containing areas in the chloroplast of Chlamydomonas, a to v chloroplastoch jednobunkovej riasy rodu Chlamydomonas.^[5] V tejto štúdii už bola zmienená hypotéza, že chloroplasty môžu byť potomkami prokaryotických endosymbiontov.^[6] O rok neskôr nasledovali v rýchlom slede správy o izolácii plastidovej DNA z najrôznejších rastlín.^[5] Ďalším úspechom vedy bola sekvenácia kompletného chloroplastového genómu. Prvýkrát sa tak stalo u pečeňovky porastnice mnohotvárnej (Marchantia polymorpha).^[7] Dodnes bolo osekvenovaných viac než 150 plastómov (plastidových genómov).^[8]

Chloroplastová DNA má niektoré vlastnosti, ktoré uľahčujú jej využitie na rôzne štúdiá v molekulárnej biológii. Tento genóm je totiž pomerne malý, prítomný v mnohých kópiách a pomerne dobre preštudovaný. Navyše pomerne pomaly mutuje a má mnoho zvláštností, ktoré robia jeho výskum zaujímavý napríklad pre evolučných či molekulárnych biológov.^[9]

Sekvenácia DNA z plastidov dnes pomáha vedcom odhaľovať napríklad evolúciu eukaryotických organizmov, hlavne tých, ktoré obsahujú plastidy. Na základe týchto sekvencií sa napríklad zisťuje, koľko sekundárnych endosymbióz prebehlo v evolučnom strome eukaryotov, ako prebieha génový transfér z organely do jadra, alebo aké sú vývojové vzťahy medzi rôznymi skupinami eukaryotov. Pracuje sa s ním aj pri zisťovaní migrácií jednotlivých druhov rastlín, napríklad údaje o rekolonizácii Európy dubom (Quercus) po skončení doby ľadovej pramenia práve z výskumu ich cpDNA.^[10] Porovnávaním sekvencií plastidovej DNA európskych dubov je možné zistiť, aké populácie sú si navzájom príbuzné, čiže pravdepodobne pochádzajú z jedného miesta.^[10]

Opis

S výnimkou nukleomorfu, ktorý je odlišného pôvodu než bežná plastidová DNA, má reťazec pDNA zrejme tvar uzavretej slučky a označuje sa tradične ako kruhový, podobne ako u väčšiny prokaryotických organizmov.^[1] Niektoré novšie štúdie však poukazujú na skutočnosť, že plastidová DNA je omnoho komplikovanejšia štruktúra, ktorá svoju stavbu mení v čase a cirkulárny typ sa objavuje skôr vzácnejšie.^[11][12] U kukurice sa dokonca pozorovali lineárne, zložito vetvené chromozómy a kruhové molekuly boli zastúpené len 3 – 4 percentami.^[13] Je však isté, že pDNA má u rôznych druhov rozmanitú veľkosť a rôzny je aj počet génov, ktoré kóduje.

Množstvo plastidovej DNA prítomnej v bunke závisí v prvom rade od počtu plastidov v bunke, ale aj na počte samotných molekúl DNA v jednom plastide a na veľkosti plastidovej DNA. Riasa Chlamydomonas má len jeden chloroplast, ale ten obsahuje až 80 molekúl DNA. Listy kukurice obsahujú v každej bunke 20 – 40 chloroplastov a každý chloroplast obsahuje 20 – 40 molekúl DNA. U kukurice tvorí plastidová DNA 15 % celkového genómu v bunke, u riasy Chlamydomonas len 7 %.^[14]

Veľkosť

Veľkosť plastidového genómu je však veľmi rozmanitá. Zatiaľ čo u zelenej riasy Stigeoclonium helveticum dosahuje 223 902 párov báz a predstavuje najväčší doteraz známy plastidový genóm,^[15] u niektorých organizmov, ktoré druhotne stratili schopnosť fotosyntézy, majú plastidové genómy omnoho menšiu veľkosť.^[16] Veľmi malé plastómy (asi okolo 35 – 40-tisíc párov báz) majú napríklad zelené riasy rodu Helicosporidium^[17] alebo druhy Eimeria tenella či Plasmodium falciparum. U vyšších rastlín má najmenší genóm tiež parazitická rastlina, ktorá sa nazýva Epifagus virginiana, a to niečo málo vyše 70 000 párov báz.^[18]

Štruktúra a gény

Všeobecná schéma chloroplastovej DNA: SSC (small single copy), dva regióny inverted repeats a LSC (large single copy)

Kruhový plastidový genóm (najmä u rastlín) má pomerne stabilnú štruktúru, v ktorej sa dajú vysledovať určité zákonitosti. Napríklad chloroplastová DNA tabaku (Nicotiana) a pečeňovky (Marchantiophyta) je takmer rovnaká.^[1] Obvykle sa na nej rozlišujú dve oblasti, ktorých sekvencie sú obsiahnuté v cpDNA vždy len raz –tzv. large single copy (LSC) a small single copy (SSC). Medzi nimi sa nachádzajú dve oblasti, ktoré obsahujú tú istú sekvenciu, ale s obráteným poradím komplementárnych báz. Táto časť sa označuje ako inverted repeat (IR), vyskytuje sa u takmer všetkých rastlín a kóduje napríklad gény pre ribozomálnu RNA. Hoci sú gény kódované v IR u rôznych druhov odlišné, v rámci jednej kruhovej molekuly sú vždy obe sekvencie zmieneného regiónu až na smer úplne zhodné a nie je známy mechanizmus, ktorý to spôsobuje.^[19] Tento región zrejme stabilizuje DNA pred výraznejšími štrukturálnymi zmenami. Napriek tomu inverted repeat úplne chýba u zástupcov čeľade bôbovitých (Fabaceae) a u niektorých ihličnanov (borovica, dúglaska).^[20] Je zrejmé, že plastidová DNA v rôznych líniách fotosyntetizujúcich organizmov prechádza značnými štruktúrnymi zmenami a niekedy sa značne odlišuje od zmieneného modelu. U niektorých panciernatiek (Dinoflagellata) je napríklad plastóm zrejme rozdelený do množstva drobných kruhových molekúl s dĺžkou len okolo 2 – 3 tisíc párov báz. Každý kruh obsahuje obvykle jeden gén, niekedy však dva alebo žiadny.^[21]

Počet úplne funkčných (prepisovaných a translatovaných) génov je tiež veľmi rozmanitý. Rádovo obsahuje jedna molekula pDNA niekoľko desiatok či stoviek génov, chloroplasty vyšších rastlín obvykle okolo 120 génov.^[1] Tieto gény kódujú štyri molekuly ribozomálnej RNA a 20 ribozomálnych proteínov (podieľajúcich sa na stavbe ribozómov v chloroplastoch), asi 30 rôzných transferových RNA, niekoľko podjednotiek chloroplastovaj RNA polymerázy, niekoľko súčastí fotosystémov I a II a ATP syntázy zúčastňujúcej sa fotosyntézy v chloroplastoch, niekoľko enzýmov elektrónového transportného reťazca, jednu podjednotku enzýmu RuBisCO a ďalšie proteíny, niektoré s neznámou funkciou.^[1] Z tohto prehľadu je pomerne zrejmé, že chloroplast nie je sebestačný a všetky jeho ostatné súčasti, napríklad malé podjednotky enzýmu RuBisCO,^[22] sú transportované do chloroplastu z cytoplazmy. K tejto situácii prispel proces horizontálneho prenosu DNA z pDNA do jadrovej DNA.

Na druhej strane, plastidová DNA vo vnútri niektorých svojich génov obsahuje aj nekódujúce oblasti, tzv. intróny, ktoré sú typické pre eukaryotov. Intróny z čerstvo vytvorenej mRNA odstraňuje proces splicingu.^[1]

Prepis, replikácia a proteosyntéza

Ribozóm v chloroplastoch slúži na transláciu pDNA

Na transkripcii plastidovej DNA sa podieľajú dve RNA polymerázy. Prvá, zložená z viacerých jednotiek, je kódovaná z veľkej časti (okrem podjednotky sigma) génmi prítomnými v pDNA. Preto sa anglicky označuje táto polymeráza ako plastid-encoded RNA polymerase čiže PEP. PEP je veľmi podobná RNA polymerázam baktérií, hlavne siníc. Druhá RNA polymeráza v chloroplaste sa skladá len z jednej podjednotky a je kódovaná génmi v samotnom bunkovom jadre (tzv. nucleus-encoded RNA polymerase, NEP). U organizmov s plastidmi, ktoré stratili svoju fotosyntetickú funkciu (napr. mnohé parazitické rastliny), dochádza obvykle k strate génov pre RNA polymerázu.^[23]

K translácii (syntéze proteínov) dochádza na ribozómoch prokaryotického typu priamo vo vnútri plastidov. Tieto ribozómy sú svojou stavbou a citlivosťou na antibiotiká veľmi podobné ribozómom baktérií. Syntéza proteínov začína v chloroplastoch transláciou N-formylmetionínu, zatiaľ čo pre eukaryotov je typický metionín.^[1] Expresia génu, tzn. miera syntézy určitých proteínov, je kontrolovaná hlavne mierou translácie na ribozómoch a je o niečo komplikovanejšia než u prokaryotov. To umožňuje koordináciu syntézy proteínov v jadre a plastide.^[24]

K replikácii genómu v plastidoch dochádza obvykle priebežne, nezávisle od fázy bunkového cyklu, v ktorej sa eukaryotická bunka nachádza. Niektorý reťazec sa preto zrejme v určitom období zreplikuje aj niekoľkokrát, zatiaľ čo iná kópia vôbec. Napriek tomu dochádza k určitej regulácii replikácie.^[1] Hlavnú úlohu v ňom zrejme hrajú plastidové DNA polymerázy, označované v niektorých štúdiách ako Os-PolI-like (Os je skratka pre rastlinu Oryza sativa, z ktorej bol enzým izolovaný). Tieto sú kódované jadrovým genómom a vykazujú značnú podobnosť s polymerázou I siníc.^[25] Samotný priebeh replikácie je zrejme pomerne odlišný od replikácia jadrovej DNA, už len preto, že pDNA sa obvykle popisuje ako kruhová. Replikácia začína v typickom prípade na dvoch miestach vzdialených 7000 párov báz, teda v každom vlákne na jednom mieste. DNA polymerázy na oboch vláknach tvoria charakteristické D-loops, ktoré sa k sebe približujú a nakoniec splývajú, ale každá DNA polymeráza pokračuje svojim smerom, čím postupne vzniká kruhová molekula, ku ktorej je na jednej strane pripojený dcérsky polkruhovitý reťazec.^[26]

Evolúcia

Na tomto fylogenetickom strome eukaryotov je zachytená jedna z predstáv, ako vznikali plastidy. Modrá šípka od baktérií k skupine Archaeplastida znázorňuje primárnu endosymbiózu, zostávajúce dva červené prúžky znázorňujú sekundárnu endosymbiózu (predstava o vzniku plastidov podľa,^[27] aktualizácia systému podľa^[28])

Plastidy a ich DNA, ktorá ukazuje nápadnú podobnosť s DNA prokaryotov, podobne ako mitochondriálna DNA, sú dokladom endosymbiotickej teórie.^[4] Na rozdiel od mitochondrií sa plastidy vyvinuli u niekoľkých, často nepríbuzných skupín eukaryotov.

Tzv. primárne plastidy pochádzajú zo siníc a vznikli pravdepodobne len raz, a to u rastlín, ktoré v širšom zmysle zahŕňajú nielen zelené rastliny (Viridiplantae), ale aj červené riasy (Rhodophyta) a Glaucophyta.^[29] Plastidy iných druhov fotosyntetizujúcich eukaryotov vznikli predovšetkým sekundárnou endosymbiózou, čiže pohltením jednej zo skupín rastlín. Pohltením červenej riasy vznikli plastidy (niekedy kvôli svojmu pôvodu nazývané rhodoplasty) napr. u rôzných heterokont (Heterokonta) a rozsievok (Bacillariophyceae), pohltením zelenej riasy vznikli plastidy u Chlorarachniophyta, niektorých červenoočiek (Euglenozoa) a jednej panciernatky (Dinoflagellata).^[4]

Dnešná pDNA kóduje len asi 5 – 10 % pôvodných genov svojich sinicových predkov. Je to buď kvôli strate niektorých génov, ktoré neboli potrebné, alebo ich prenosom do jadra.^[30] V druhom prípade ide o proces tzv. horizontálneho prenosu (transferu) genetickej informácie, vďaka ktorému je množstvo génov pôvodne pochádzajúcich z plastidu (a ešte skôr z genómu siníc) v súčasnosti začlenených do jadrovej DNA.^[1] Zistilo sa, že v jadrovej DNA druhu Arabidopsis thaliana je prítomých až 4 500 génov, ktoré pochádzajú zo siníc, z ktorých vznikli plastidy. To tvorí 18 % z celkového počtu génov tohto druhu. Množstvo génov, ktoré táto rastlina dnes obsahuje, sa v niektorých iných skupinách organizmov stále vyskytuje v ich chloroplastovej DNA.^[30]

V súvislosti s horizontálnym transferom je možno uviesť, že neprebieha iba výmena genómu medzi plastidom a jadrom, ale aj medzi plastidom a mitochondriou. Prenos opačným smerom, tzn. z vonkajšieho prostredia do plastidu, je zrejme vzácnejší jav, ale už bol tiež zaznamenaný. V takomto prípade sa obvykle do plastidovej DNA začleňuje sekvencia génov niektorých baktériofágov (jav nazývaný transdukcia) alebo napr. sekvencia parazitickej baktérie Agrobacterium tumefaciens.^[31]

Dedičnosť

Dedičnosť pDNA pri pohlavnom rozmnožovaní súvisí so spôsobom prenosu semiautonómnych organel z pohlavných buniek do vznikajúcej zygoty. Asi u dvoch tretín vyšších rastlín sa pDNA prenáša len zo samičích pohlavných buniek (maternálne). Samčie chloroplasty z peľových zŕn teda nevstupujú do zygoty. U ostatných vyšších rastlín sa do zygoty dostanú samičie aj samčie chloroplasty a dedičnost pDNA je teda biparentálna.^[1] Možno povedať, že maternálnu dedičnosť prejavuje väčšina krytosemenných (hoci niektoré z nich sú taktiež biparentálne). Hlavne u niektorých nahosemenných však bola objavená výhradne paternálna dedičnosť, tzn. že všetka plastidová DNA v potomstve pochádza z peľového zrna. Mechanizmy odstránenia plastidov jedného pohlavia sú obvykle komplikované a môžu pôsobiť pred alebo po oplodnení.^[32]

Keď nejaká rastlina s biparentálnou dedičnosťou plastidov zdedí od jedného z rodičov defektný plastid (tzn. defekt spôsobený určitými mutáciami v pDNA), je niekedy možné pozorovať na listoch mozaikovitú zeleno-bielu štruktúru, pretože určité časti jej pletív sú schopné fotosyntetizovať a iné nie. Tento jav sa nazýva variegácia.^[1]

Keďže plastidová DNA nie je súčasťou jadrového genómu, prenos jej genetickej informácie patrí medzi mimojadrovú dedičnosť.