Окислительное декарбоксилирование пирувата

Окисли́тельное декарбоксили́рование пирува́та — биохимический процесс, заключающийся в отщеплении одной молекулы углекислого газа (СО₂) от молекулы пирувата и присоединении к декарбоксилированному пирувату кофермента А (КоА) с образованием ацетил-КоА; является промежуточным этапом между гликолизом и циклом трикарбоновых кислот. Декарбоксилирование пирувата осуществляет сложный пируватдегидрогеназный комплекс (ПДК), включающий в себя 3 фермента и 2 вспомогательных белка, а для его функционирования необходимы 5 кофакторов (КоА, НАД⁺, тиаминпирофосфат (ТПФ), ФАД и липоевая кислота (липоат)). Суммарное уравнение окислительного декарбоксилирования пирувата таково^[1]:

У эукариот пируватдегидрогеназный комплекс локализован в митохондриях, у бактерий — в цитозоле. Образующийся в результате ацетил-КоА далее вовлекается в цикл Кребса^[1].

Окислительное декарбоксилирование пирувата — необратимый процесс. Образующийся в ходе этого процесса НАДН впоследствии отдаёт гидридный ион (Н^-) в дыхательную цепь, в которой при аэробном дыхании конечным акцептором электронов является кислород, а при анаэробном — другие окисленные соединения (например, сульфат, нитрат). Перенос электронов с НАДН на кислород даёт 2,5 молекулы АТФ на пару электронов. Необратимость реакции, осуществляемой пируватдегидрогеназным комплексом, была показана в исследованиях с применением радиоактивных изотопов: комплекс не может обратно присоединить меченый СО₂ к ацетил-КоА с образованием пирувата^[2].

Помимо окислительного, существует неокислительное декарбоксилирование пирувата до ацетальдегида (и далее до этанола) и СО₂. Этот процесс осуществляется ферментом пируватдекарбоксилазой, к нему способны многие растения, дрожжи и некоторые бактерии^[3].

Коферменты

Некоторые коферменты ПДК

Тиаминпирофосфат (ТПФ)

Липоевая кислота (липоат)

Кофермент А

Комбинированное дегидрирование и декарбоксилирование пирувата до ацильной группы^[англ.], которая в дальнейшем войдёт в ацетил-КоА, осуществляется тремя различными ферментами, для функционирования которых необходимы 5 различных коферментов или простетических групп: тиаминпирофосфат (ТПФ), ФАД, кофермент А (КоА), НАД и липоат. Четыре из них являются производными витаминов: тиамина, или витамина В₁ (ТПФ), рибофлавина, или витамина В₂ (ФАД), ниацина, или витамина РР (НАД) и пантотеновой кислоты, или витамин В₅ (КоА)^[4].

ФАД и НАД являются переносчиками электронов, а ТПФ известен также как кофермент пируватдекарбоксилазы, участвующей в брожении^[4].

Кофермент А имеет активную тиольную группу (—SH), которая имеет критическое значение для функционирования КоА в качестве переносчика ацильной группы в ряде метаболических реакций. Ацильные группы при этом ковалентно связываются с тиольной группой, образуя тиоэфиры. Из-за их относительно высокой стандартной свободной энергии гидролиза тиоэфиры обладают высокой способностью к переносу ацильных групп к различным молекулам-акцепторам. Поэтому ацетил-КоА иногда также называют «активированной уксусной кислотой»^[4][5].

Пятый кофактор пируватдегидрогеназного комплекса, остаток липоевой кислоты — липоат, имеет две тиольные группы, которые могут подвергаться обратимому окислению с образованием дисульфидной связи (—S—S—), подобно тому, как это происходит между двумя остатками аминокислоты цистеина в белке. Из-за своей способности подвергаться окислению и восстановлению липоат может служить в качестве переносчика как электронов (или H⁺), так и ацильных групп^[4].

Пируватдегидрогеназный комплекс

Основная статья: Пируватдегидрогеназный комплекс

Пируватдегидрогеназный комплекс (ПДК)

Трёхмерная модель ПДК

Схематическое изображение ПДК с указанием ферментов (Е₁, Е₂, Е₃). Зелёным цветом выделена коровая часть, синим — липоильный домен Е₂, который продолжается вперёд до соприкосновения с активными центрами молекул Е₁ (жёлтый цвет). С кором^[англ.] также связано несколько субъединиц Е₃ (красный), и, раскачиваясь, «рука» Е₂ может достать до их активных центров

Пируватдегидрогеназный комплекс (ПДК) включает 3 фермента: пируватдегидрогеназу^[англ.] (Е₁), дигидролипоилтрансацетилазу (Е₂) и дигидролипоилдегидрогеназу^[англ.] (Е₃). Каждый из этих ферментов присутствует в комплексе во множестве копий. Количество копий каждого фермента, а следовательно, и размер комплекса варьирует среди различных видов.

Комплекс ПДК млекопитающих достигает около 50 нм в диаметре, что более чем в 5 раз превышает диаметр целой рибосомы; эти комплексы достаточно велики, чтобы быть различимыми в электронный микроскоп. В ПДК коровы входят 60 идентичных копий Е₂, которые формируют пентагональный додекаэдр (коровая часть^[англ.] комплекса) диаметром около 25 нм.

В кор ПДК у бактерии Escherichia coli входит 24 копии Е₂. К Е₂ присоединяется простетическая группа липоат (остаток альфа-липоевой кислоты) с аминокислотой лизином, которая связывается амидной связью с ε-аминогруппе остатка лизина, входящего в состав Е₂. Е₂ состоит из трёх функционально различных доменов: аминотерминального липоильного домена, содержащего остаток лизина, связывающийся с липоатом; центрального Е₁- и Е₃-связывающего домена; внутреннего корового ацилтрансферазного домена, содержащего активные центры ацилтрансферазы. У дрожжей в ПДК имеется единственный липоильный домен, у млекопитающих — два, а у E. coli — три. Домены Е₂ связываются линкерными последовательностями, состоящими из 20—30 аминокислотных остатков, причём в них остатки аланина и пролина перемежаются с заряженными аминокислотыми остатками^[6].

С активным центром Е₁ связывается ТПФ, а с активным центром Е₃ — ФАД. Также в состав комплекса ПДК входят два регуляторных белка — протеинкиназа и фосфопротеинфосфатаза. Такая основная структура из Е₁-Е₂-Е₃ оставалась консервативной в ходе эволюции. Комплексы такого устройства принимают участие и в других реакциях, например, окислении α-кетоглутарата в ходе цикла Кребса и окислении α-кетокислот, образующихся при катаболической утилизации разветвлённых аминокислот: валина, изолейцина, лейцина. У изученных видов Е₃ ПДК идентичен Е₃ двух вышеупомянутых комплексов. Примечательное сходство структур белков, кофакторов и механизмов реакций, осуществляемых этими комплексами, свидетельствует об общности их происхождения^[1]. При прикреплении липоата к лизину Е₂ образуется длинная, гибкая «рука», которая может перемещаться с активного центра Е₁ в активные центры Е₂ и Е₃, то есть на расстояния предположительно 5 нм и более^[7].

Механизм

Окислительное декарбоксилирование пирувата включает несколько стадий:

• Стадия 1 идентична пируватдекарбоксилазной реакции. Первый атом углерода (С-1) пирувата уходит в виде СО₂, а С-2, в пирувате находящийся в альдегидной форме, прикрепляется к ТПФ в виде гидроксиэтильной группы (—СНОН—СН₃). Первая стадия является наиболее медленной и поэтому ограничивает скорость всего процесса. Кроме того, на этом этапе комплекс ПДК проявляет свою субстратную специфичность. Эта реакция осуществляется пируватдегидрогеназой (Е₁).
• Стадия 2. Гидроксиэтильная группа окисляется до карбоновой кислоты (ацетата). Два электрона, освобождаемых при этой реакции, идут на восстановление связи —S—S— липоильной группы Е₂ до двух тиольных (—SH) групп.
• Стадия 3. Ацетильный остаток, образующийся в ходе окислительно-восстановительной реакции на стадии 2, сначала связывается тиоэфирной связью с липоильной —SH-группой, а затем переносится на КоА с образованием ацетил-КоА. Таким образом, энергия окисления идёт на образование высокоэнергетического тиоэфира ацетата. Стадии 2 и 3 катализируются дигидролипоилтрансацетилазой (Е₂).
• Стадия 4 и стадия 5 катализируются дигидролипоилдегидрогеназой (Е₃). В ходе этих двух последних реакций восстановленный липоиллизин снова возвращается в окисленную форму, который в дальнейшем может участвовать в следующем цикле окислительного декарбоксилирования пирувата. Электроны, изначально принадлежавшие гидроксиэтильной группе, при этом переносятся с липоиллизина сначала на ФАД с образованием ФАДH₂, а потом на НАД⁺ с образованием НАДН + H^+[8].

Схема окислительного декарбоксилирования пирувата

Центральную роль в реакции, осуществляемой комплексом ПДК, играют липоиллизиновые «руки» Е₂, способные «раскачиваться» и забирать два электрона от Е₁, а также ацетильную группу, образовавшуюся из пирувата, и доставлять электроны к Е₃. Все эти ферменты и коферменты собраны в комплекс, благодаря чему промежуточные соединения могут вступать в необходимые реакции быстро и не диффундируя с поверхности ферментного комплекса. За счёт этого промежуточные соединения не покидают комплекса, и поддерживается очень высокая локальная концентрация субстрата Е₂. Это также предотвращает перехватывание активированной ацетильной группы другими ферментами, использующими её в качестве субстрата^[8].

Органические соединения, содержащие мышьяк, являются ингибиторами ПДК, поскольку взаимодействуют с восстановленными в ходе окислительного декарбоксилирования пирувата тиольными группами липоильной группы Е₂ и блокируют их нормальную работу^[9].

Регуляция

У млекопитающих ПДК сильно подавляется АТФ, а также продуктами реакции: ацетил-КоА и НАДН. Аллостерическое подавление окисления пирувата значительно усиливается в присутствии длинноцепочечных жирных кислот. АМФ, КоА и НАД⁺, накапливающиеся тогда, когда в цикл Кребса поступает слишком мало ацетата, аллостерически активируют комплекс ПДК. Таким образом, ферментный комплекс подавляется, когда имеется достаточно ацетил-КоА или сырья (жирные кислоты) для осуществления альтернативных путей образования ацетил-КоА, а отношения [АТФ]/[АДФ] и [НАДН]/[НАД⁺] достаточно велики. Напротив, при большой потребности в энергии и необходимости большего количества ацетил-КоА для функционирования цикла Кребса ПДК активируется^[10].

У млекопитающих к этим аллостерическим механизмам добавляется второй уровень регуляции: ковалентная модификация белка. Комплекс ПДК подавляется обратимым фосфорилированием по специфическим остаткам серина на одной из двух субъединиц E₁. Ранее отмечалось, что, помимо субъединиц E₁, E₂ и E₃ у млекопитающих в комплекс ПДК входят два регуляторных белка, единственным назначением которых является регуляция активности комплекса. Специфичная протеинкиназа фосфорилирует и тем самым инактивирует E₁, а специфичная фосфопротеинфосфатаза удаляет фосфатные группы путём гидролиза и тем самым активирует E₁. Киназа аллостерически активируется АТФ: когда концентрация АТФ велика (что свидетельствует о достаточном количестве энергии в клетке), комплекс ПДК инактивируется фосфорилированием E₁. Когда [АТФ] понижена, активность киназы снижается, и фосфатаза убирает фосфатные группы с E₁, активируя комплекс^[11].

Комплекс ПДК растений, располагающийся в матриксе митохондрий и пластидах, подавляется продуктами его активности — НАДН и ацетил-КоА. Растительный митохондриальный фермент также регулируется обратимым фосфорилированием: пируват подавляет киназу, активируя ПДК, а NH₄⁺ стимулирует киназу и инактивирует комплекс. У E. coli ПДК регулируется аллостерически по схожему с млекопитающими механизму, однако, по-видимому, не регулируется фосфорилированием^[11].

Клиническое значение

Четыре витамина (тиамин, рибофлавин, ниацин, пантотеновая кислота), из которых образуются коферменты ПДК, обязательно должны присутствовать в рационе человека^[4]. Кроме того, мутации генов, кодирующих субъединицы ПДК, а также недостаток тиамина в пище могут иметь очень серьёзные последствия. Животные, испытывающие недостаток тиамина, не могут нормально окислять пируват. Особенно это важно для мозга, который обычно получает энергию при аэробном окислении глюкозы, а этот процесс обязательно включает окисление пирувата.

Бери-бери — заболевание, развивающееся при недостатке тиамина — характеризуется расстройством функций нервной системы. Эта болезнь обычно встречается в популяциях людей, чей рацион состоит в основном из белого (очищенного) риса, лишённого шелухи, в которой содержится большая часть тиамина риса. Недостаточность тиамина может также развиться у людей, постоянно употребляющих алкоголь, так как большая часть получаемой ими энергии приходится на «пустые калории» очищенного спирта, лишённого витаминов. Повышенное содержание пирувата в крови часто является индикатором нарушений в окислении пирувата из-за одной из вышеперечисленных причин^[12].

Другие пути преобразования пирувата

У некоторых микроорганизмов преобразование пирувата в ацетил-КоА (или другие продукты) может осуществляться и другими способами, помимо вышеописанного (комплекс ПДК используется аэробами). Такими преобразованиями могут быть:

• пируват + КоА + ФАД → ацетил-КоА + ФАДH₂ + СО₂. Реакция катализируется пируват:ферредоксин оксиредуктазой^[англ.], характерна для анаэробов, в частности, клостридий. Из ФАДH₂ далее при участии гидрогеназы образуется молекулярный водород.
• пируват + КоА → ацетил-КоА + формиат. Фермент — пируватформиатлиаза^[англ.], реакция характерна для Enterobacteriaceae, фотобактерий^[англ.] и некоторых фототрофов.
• пируват → ацетальдегид + СО₂. Фермент — пируватдекарбоксилаза, реакция характерна для дрожжей^[13].

Примечания

1. Nelson, Cox, 2008, p. 616.
2. Nelson, Cox, 2008, p. 616—617.
3. van Zyl L. J., Schubert W. D., Tuffin M. I., Cowan D. A. Structure and functional characterization of pyruvate decarboxylase from Gluconacetobacter diazotrophicus. (англ.) // BMC structural biology. — 2014. — Vol. 14, no. 1. — P. 21. — doi:10.1186/s12900-014-0021-1. — PMID 25369873. [исправить]
4. Nelson, Cox, 2008, p. 617.
5. Нетрусов, Котова, 2012, с. 123.
6. Nelson, Cox, 2008, p. 618.
7. Nelson, Cox, 2008, p. 618—619.
8. Nelson, Cox, 2008, p. 619.
9. Pyruvate Dehydrogenase & Krebs Cycle  (неопр.). Дата обращения: 3 января 2015. Архивировано из оригинала 11 февраля 2015 года.
10. Nelson, Cox, 2008, p. 635—636.
11. Nelson, Cox, 2008, p. 636.
12. Nelson, Cox, 2008, p. 620.
13. Нетрусов, Котова, 2012, с. 123, 128.

Литература

• David L. Nelson, Michael M. Cox. Lehninger Principles of biochemistry. — Fifth edition. — New York: W. H. Freeman and company, 2008. — 1158 p. — ISBN 978-0-7167-7108-1.
• David E. Metzler. Biochemistry: The Chemical Reactions of Living Cells.. — 2nd edition. — Academic Press, 2003. — Т. 2. — 1973 с. — ISBN 978-0-1249-2541-0.
• Нетрусов А. И., Котова И. Б. Микробиология. — 4-е изд., перераб. и доп.. — М.: Издательский центр «Академия», 2012. — 384 с. — ISBN 978-5-7695-7979-0.