PBR322

pBR322 — плазмида, используемая в бактериях E. coli как вектор клонирования. Создана в 1977 году мексиканскими биологами Франциско Боливаром^[англ.] и Раймондом Родригесом^[1].

Карта плазмиды pBR 322

pBR322 содержит 4361 нуклеотидную пару^[2] и состоит из участка репликации ori (взят из плазмиды pMB1^[англ.]); гена amp^R, кодирующего белок, обеспечивающий устойчивость к ампициллину (взят из плазмиды RSF2124^[англ.]) и гена tet^R, обеспечивающего устойчивость к тетрациклину (взят из плазмиды pSC101^[англ.]). Плазмида содержит уникальные сайты рестрикции для более чем 40 рестриктаз. 11 из этих 40 сайтов находятся внутри гена tet^R, причём 2 сайта (HindIII^[англ.] и ClaI^[англ.]) расположены внутри промотора этого гена. 6 сайтов находятся внутри гена amp^R. Участок репликации ori^[англ.], заимствованный из плазмиды pMB1, сходен по структуре с ColE1^[3]. Он кодирует две РНК (RNAI и RNAII) и один белок (Rom или Rop).

Молекулярная масса плазмиды составляет 2,83⋅10⁶ дальтон^[4].

Код в базе данных GenBank — J01749^[5].

Нумерацию нуклеотидных пар принято начинать с центральной линии уникального сайта рестрикции EcoRI в направлении гена tet. Ген устойчивости к ампициллину – пенициллиновая бета-лактамаза (англ. penicillin beta-lactamase) с промотерами P1 и P3. P3 является естественным промотором, а P1 создан искусственно лигированием двух различных фрагментов ДНК. Промотер P2 аналогичен P1, однако расположен на противоположной стороне плазмиды и инициирует транскрипцию в направлении гена устойчивости к тетрациклину^[5].

История создания

В 1975 году, когда Франциско Боливар^[англ.] начал работу в Калифорнийском университете в Сан-Франциско в составе группы Герберта Бойера, инструментарий, имевшийся в распоряжении молекулярных биологов, был крайне беден. Векторы клонирования имели очень большую молекулярную массу, их свойства были плохо изучены, удобные сайты клонирования отсутствовали^[6].

Группа Бойера, в состав которой входило несколько талантливых биологов, занималась клонированием и изучением некоторых специфических генов. Однако работа продвигалась крайне медленно из-за отсутствия удобных инструментов, в первую очередь векторов клонирования, а также достаточно чистых эндонуклеаз рестрикции и ДНК-лигазы Т4. Со временем некоторые члены группы пришли к мысли о создании более совершенного инструментария.

В первое время Бойер не одобрял занятий своих сослуживцев, и большую часть работы пришлось проделать в нерабочее время. Однако когда плазмида pBR322 была создана, он стал активным сторонником и пропагандистом нового инструмента, заменив им использовавшуюся ранее плазмиду pMB9. Новая плазмида быстро распространилась по научному сообществу, в течение первых дней её получили более 300 лабораторий по всему миру. Оригинальный метод клонирования путём деактивации генов сопротивляемости к антибиотикам позволял легко планировать эксперименты и быстро анализировать полученные данные.

В то время проблемы биологической безопасности считалась чрезвычайно актуальными, поэтому плазмида была создана с сильно ограниченными возможностями распространения за пределами лаборатории. Она стала первым вектором типа EK2, сертифицированная Национальным институтом здоровья^[англ.] как соответствующая требованиям безопасности для рекомбинантных ДНК.

Наконец, очень сильно способствовало популярности новой плазмиды расшифровка и опубликование в 1979 году её нуклеотидной последовательности, сделанное Грегом Сатклиффом (англ. Greg Sutcliffe) из лаборатории Уолтера Гилберта^[7].

В течение десятилетий pBR322 активно использовалась в генных исследованиях. Её кодовая последовательность и функции генов были настолько хорошо изучены, что стали использоваться как компоненты при создании новых инструментальных плазмид.

Оригинальная статья в журнале Gene^[1], где было описано создание плазмиды, стала одним из лидеров по числу цитирований среди статей по молекулярной биологии в 1970-х и начале 1980-х годов^[8].

Структура плазмиды

Нуклеотидная последовательность

Нуклеотидная последовательность pBR322 следующая^[5]

pBR322 1 TTCTCATGTT TGACAGCTTA TCATCGATAA GCTTTAATGC GGTAGTTTAT CACAGTTAAA 61 TTGCTAACGC AGTCAGGCAC CGTGTATGAA ATCTAACAAT GCGCTCATCG TCATCCTCGG 121 CACCGTCACC CTGGATGCTG TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTACTGC CGGGCCTCTT 181 GCGGGATATC GTCCATTCCG ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCGTGCTGC TAGCGCTATA 241 TGCGTTGATG CAATTTCTAT GCGCACCCGT TCTCGGAGCA CTGTCCGACC GCTTTGGCCG 301 CCGCCCAGTC CTGCTCGCTT CGCTACTTGG AGCCACTATC GACTACGCGA TCATGGCGAC 361 CACACCCGTC CTGTGGATCC TCTACGCCGG ACGCATCGTG GCCGGCATCA CCGGCGCCAC 421 AGGTGCGGTT GCTGGCGCCT ATATCGCCGA CATCACCGAT GGGGAAGATC GGGCTCGCCA 481 CTTCGGGCTC ATGAGCGCTT GTTTCGGCGT GGGTATGGTG GCAGGCCCCG TGGCCGGGGG 541 ACTGTTGGGC GCCATCTCCT TGCATGCACC ATTCCTTGCG GCGGCGGTGC TCAACGGCCT 601 CAACCTACTA CTGGGCTGCT TCCTAATGCA GGAGTCGCAT AAGGGAGAGC GTCGACCGAT 661 GCCCTTGAGA GCCTTCAACC CAGTCAGCTC CTTCCGGTGG GCGCGGGGCA TGACTATCGT 721 CGCCGCACTT ATGACTGTCT TCTTTATCAT GCAACTCGTA GGACAGGTGC CGGCAGCGCT 781 CTGGGTCATT TTCGGCGAGG ACCGCTTTCG CTGGAGCGCG ACGATGATCG GCCTGTCGCT 841 TGCGGTATTC GGAATCTTGC ACGCCCTCGC TCAAGCCTTC GTCACTGGTC CCGCCACCAA 901 ACGTTTCGGC GAGAAGCAGG CCATTATCGC CGGCATGGCG GCCGACGCGC TGGGCTACGT 961 CTTGCTGGCG TTCGCGACGC GAGGCTGGAT GGCCTTCCCC ATTATGATTC TTCTCGCTTC 1021 CGGCGGCATC GGGATGCCCG CGTTGCAGGC CATGCTGTCC AGGCAGGTAG ATGACGACCA 1081 TCAGGGACAG CTTCAAGGAT CGCTCGCGGC TCTTACCAGC CTAACTTCGA TCACTGGACC 1141 GCTGATCGTC ACGGCGATTT ATGCCGCCTC GGCGAGCACA TGGAACGGGT TGGCATGGAT 1201 TGTAGGCGCC GCCCTATACC TTGTCTGCCT CCCCGCGTTG CGTCGCGGTG CATGGAGCCG 1261 GGCCACCTCG ACCTGAATGG AAGCCGGCGG CACCTCGCTA ACGGATTCAC CACTCCAAGA 1321 ATTGGAGCCA ATCAATTCTT GCGGAGAACT GTGAATGCGC AAACCAACCC TTGGCAGAAC 1381 ATATCCATCG CGTCCGCCAT CTCCAGCAGC CGCACGCGGC GCATCTCGGG CAGCGTTGGG 1441 TCCTGGCCAC GGGTGCGCAT GATCGTGCTC CTGTCGTTGA GGACCCGGCT AGGCTGGCGG 1501 GGTTGCCTTA CTGGTTAGCA GAATGAATCA CCGATACGCG AGCGAACGTG AAGCGACTGC 1561 TGCTGCAAAA CGTCTGCGAC CTGAGCAACA ACATGAATGG TCTTCGGTTT CCGTGTTTCG 1621 TAAAGTCTGG AAACGCGGAA GTCAGCGCCC TGCACCATTA TGTTCCGGAT CTGCATCGCA 1681 GGATGCTGCT GGCTACCCTG TGGAACACCT ACATCTGTAT TAACGAAGCG CTGGCATTGA 1741 CCCTGAGTGA TTTTTCTCTG GTCCCGCCGC ATCCATACCG CCAGTTGTTT ACCCTCACAA 1801 CGTTCCAGTA ACCGGGCATG TTCATCATCA GTAACCCGTA TCGTGAGCAT CCTCTCTCGT 1861 TTCATCGGTA TCATTACCCC CATGAACAGA AATCCCCCTT ACACGGAGGC ATCAGTGACC 1921 AAACAGGAAA AAACCGCCCT TAACATGGCC CGCTTTATCA GAAGCCAGAC ATTAACGCTT 1981 CTGGAGAAAC TCAACGAGCT GGACGCGGAT GAACAGGCAG ACATCTGTGA ATCGCTTCAC 2041 GACCACGCTG ATGAGCTTTA CCGCAGCTGC CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC 2101 CTCTGACACA TGCAGCTCCC GGAGACGGTC ACAGCTTGTC TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC 2161 AGACAAGCCC GTCAGGGCGC GTCAGCGGGT GTTGGCGGGT GTCGGGGCGC AGCCATGACC 2221 CAGTCACGTA GCGATAGCGG AGTGTATACT GGCTTAACTA TGCGGCATCA GAGCAGATTG 2281 TACTGAGAGT GCACCATATG CGGTGTGAAA TACCGCACAG ATGCGTAAGG AGAAAATACC 2341 GCATCAGGCG CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC 2401 GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC TCAAAGGCGG TAATACGGTT ATCCACAGAA TCAGGGGATA 2461 ACGCAGGAAA GAACATGTGA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC CAGGAACCGT AAAAAGGCCG 2521 CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT 2581 CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA 2641 GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC 2701 TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCATA GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT 2761 AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG 2821 CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG 2881 CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT 2941 TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC 3001 TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG 3061 CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATCTC 3121 AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT 3181 AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA 3241 AATGAAGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT 3301 GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT 3361 GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT ACCATCTGGC CCCAGTGCTG 3421 CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG CTCCAGATTT ATCAGCAATA AACCAGCCAG 3481 CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA 3541 ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG 3601 CCATTGCTGC AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA TTCAGCTCCG 3661 GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT 3721 CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA 3781 TGGCAGCACT GCATAATTCT CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG 3841 GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC 3901 CGGCGTCAAC ACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG CTCATCATTG 3961 GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA 4021 TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG 4081 GGTGAGCAAA AACAGGAAGG CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT 4141 GTTGAATACT CATACTCTTC CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC 4201 TCATGAGCGG ATACATATTT GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG GTTCCGCGCA 4261 CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCTGACGTCT AAGAAACCAT TATTATCATG ACATTAACCT 4321 ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTTC GTCTTCAAGA A

Гены

Источник информации^[9].

Ген	Нуклеотидная последовательность	Источник	Примечание
tet (TcR)	86—1276	pSC101	Устойчивость к тетрациклину
bla (ApR)	4153—3293	Tn3	Устойчивость к ампициллину
rop	1915—2106	pMB1	Белок Rop
ori	3122—2534	pMB1	Участок репликации

Сайты рестрикции

Жирным шрифтом выделены уникальные сайты^[9].

По координатам			По алфавиту
Сайт	Координата	Ген	Сайт	Координата	Ген
ClaI-BspDI	23		AatII-ZraI	4284
HindIII	29		AcuI	3000	ori
EcoRV	185	tet	AcuI	4048	amp
BmtI-NheI	229	tet	AhdI	3361	amp
BamHI	375	tet	AlwNI	2884	ori
SgrAI	409	tet	AseI	3537	amp
BanII	471	tet	AvaI-BsoBI	1425
BanII	485	tet	BamHI	375	tet
BtgI	528	tet	BanII	471	tet
SphI	562	tet	BanII	485	tet
EcoNI	622	tet	BciVI	2682	ori
SalI-AccI-HincII	651	tet	BciVI	4209
PshAI	712	tet	BmtI-NheI	229	tet
EagI	939	tet	BsaAI	2225
BseYI	949	tet	BsaBI	1668
NruI	972	tet	BsaI	3433	amp
BstAPI	1045	tet	BseYI	949	tet
BspMI-BfuAI	1063	tet	BseYI	2777	ori
PflMI	1315		BsgI	1650
BsmI	1353		BsmBI	2122
PflMI	1364		BsmI	1353
StyI	1369		BspEI	1664
AvaI-BsoBI	1425		BspMI-BfuAI	1063	tet
PpuMI	1438		BspQI-SapI	2350
MscI	1444		BsrBI	2404
BtgI	1447		BsrBI	4205
PpuMI	1480		BsrDI	3420	amp
BsgI	1650		BsrDI	3602	amp
BspEI	1664		BstAPI	1045	tet
BsaBI	1668		BstAPI	2291
XmnI	2029	rop	BstZ17I-AccI	2244
PvuII	2064	rop	BtgI	528	tet
BsmBI	2122		BtgI	1447
DrdI	2162		BtsI	3759	amp
Tth111I-PflFI	2217		BtsI	3787	amp
BsaAI	2225		ClaI-BspDI	23
BstZ17I-AccI	2244		DrdI	2162
BstAPI	2291		DrdI	2575	ori
NdeI	2295		EagI	939	tet
BspQI-SapI	2350		EarI	2351
EarI	2351		EarI	4155
BsrBI	2404		EcoNI	622	tet
PciI-AflIII	2473		EcoRI	4359
DrdI	2575	ori	EcoRV	185	tet
BciVI	2682	ori	HincII	3905	amp
BseYI	2777	ori	HindIII	29
AlwNI	2884	ori	MscI	1444
AcuI	3000	ori	NdeI	2295
AhdI	3361	amp	NruI	972	tet
BsrDI	3420	amp	PciI-AflIII	2473
BsaI	3433	amp	PflMI	1315
AseI	3537	amp	PflMI	1364
BsrDI	3602	amp	PpuMI	1438
PstI	3607	amp	PpuMI	1480
PvuI	3733	amp	PshAI	712	tet
BtsI	3759	amp	PstI	3607	amp
BtsI	3787	amp	PvuI	3733	amp
ScaI	3844	amp	PvuII	2064	rop
HincII	3905	amp	SalI-AccI-HincII	651	tet
XmnI	3961	amp	ScaI	3844	amp
AcuI	4048	amp	SgrAI	409	tet
EarI	4155		SphI	562	tet
SspI	4168		SspI	4168
BsrBI	4205		StyI	1369
BciVI	4209		Tth111I-PflFI	2217
AatII-ZraI	4284		XmnI	2029	rop
EcoRI	4359		XmnI	3961	amp

Плазмида pBR322 в массовой культуре

По сюжету романа Майкла Крайтона «Парк юрского периода» части плазмиды pBR322 используются для воссоздания ДНК динозавров^[10]. Хотя само название плазмиды не упоминается на страницах книги, там приводится последовательность нуклеотидов, являющаяся по сюжету фрагментом восстановленной ДНК динозавра. Поиск в базе данных GenBank при помощи поисковой программы BLASTN находит большое количество совпадений с генной последовательностью pBR322.

См. также

• Вектор (биология)#Пример клонирования ДНК

Ссылки

• Overview
• ETHZ/Biology/Lab
• Restriction Maps. pBR322.
• Bacterial Vectors >> pBR 322 Plasmids.
• J. Gregor Sutcliffe. The Sequence of pBR322 (неопр.) // Current Contents. — December 17, 1990. — Т. 51. — С. 22.

Примечания

1. Bolivar F., Rodriguez R.L., Greene P.J., Betlach M.C., Heyneker H.L., Boyer H.W., Crosa J.H., Falkow S. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system (англ.) // Gene^[англ.] : journal. — Elsevier, 1977. — Vol. 2, no. 2. — P. 95—113. — PMID 344137. Архивировано 9 апреля 2018 года.
2. Watson, N. A new revision of the sequence of plasmid pBR322 (англ.) // Gene^[англ.]. — Elsevier, 1988. — Vol. 70, no. 2. — P. 399—403. — doi:10.1016/0378-1119(88)90212-0. — PMID 3063608.
3. Qiagen Plasmid Resource Center. Growth of Bacterial Cultures  (неопр.). Архивировано 16 октября 2005 года.
4. pBR322 Vector Архивировано 13 октября 2010 года..
5. pBR322 Nucleotide Sequences, NCBI Sequence Viewer v2.0  (неопр.).
6. Все материалы данного раздела, кроме абзацев, где источник указан особо, взяты из статьи Francisco Bolivar Zapata. Multipurpose Tools in Molecular Biology (неопр.) // Current Contents. — November 19, 1990. — Т. 47. — С. 12. Архивировано 7 июня 2013 года.
7. Sutcliffe J. G. (1979) Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322 Архивная копия от 28 мая 2016 на Wayback Machine. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43: 77—80, PMID 383387.
8. Garfield E. (1 October 1984) The articles most cited in 1961-1982. 4. 100 additional Citation Classics Архивная копия от 28 июня 2010 на Wayback Machine. Current Contents, 40: 3—9.
9. Restriction Maps. pBR322 Архивировано 26 июня 2011 года..
10. Mark Boguski. A Molecular Biologist Visits Jurassic Park (англ.) // Biotechniques^[англ.] : journal. — 1992. — Vol. 12. — P. 668—669. Архивировано 20 ноября 2008 года.