Эндонуклеазы рестрикции

Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. restrictio — ограничение, следует отказаться от термина "рестриктаза", как вульгаризованного) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот.

В отличие от экзонуклеаз, эндонуклеазы рестрикции расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждый такой фермент узнаёт определённый участок ДНК (сайт) длиной от четырёх пар нуклеотидов (возможно вырождение) и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его.

Защита бактериального генома от собственной эндонуклеазы рестрикции осуществляется, как правило, с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина (маскирования)^[1].

При проведении дайджеста в неоптимальных условиях (особенно при превышении концентрации фермента) эндонуклеазы проявляют звёздчатую активность (снижение специфичности рестрикции).

Классификация

Выделяют три основных типа (или класса) ферментов рестрикции, сайты узнавания для которых могут быть симметричными (палиндромными) и несимметричными^[2]:

• Эндонуклеазы рестрикции первого типа (например, ЕсоК из Escherichia coli К12) узнают определённую последовательность нуклеотидов и разрезают двуцепочную молекулу ДНК неподалёку от этой последовательности в произвольной точке, и само место разреза не строго специально (по-видимому, после образования комплекса с ДНК фермент неспецифически взаимодействует с удалённой областью ДНК или передвигается вдоль цепи ДНК). Обладают рестриктазной, метилазной и АТФазной активностями.
• Эндонуклеазы рестрикции второго типа (например, EcoRI, XbaI) узнают определённую последовательность и разрезают двойную цепь ДНК в определённой фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции этого типа узнают палиндромные последовательности, которые обладают центральной осью и считываются одинаково в обе стороны от оси симметрии. Не обладают АТФазной активностью.
• Эндонуклеазы рестрикции третьего промежуточного типа (например, EcoPI) узнают нужную последовательность и разрезают двуцепочную молекулу ДНК, отступив определённое число нуклеотидных пар от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания). При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5'- или 3'-концами. Эти эндонуклеазы рестрикции узнают асимметричные сайты. Эти их свойства широко используются в различных методах сборки ДНК in vitro, как, например, сборка Golden Gate. Эти эндонуклеазы рестрикции обладают рестриктазной,метилазной и АТФ-азной активностями

К 2007 году выделено более трёх тысяч эндонуклеаз рестрикции.^[3] Более шестисот эндонуклеаз рестрикции доступны в виде коммерческих препаратов и повседневно используются в лабораториях для модификации ДНК и решения генно-инженерных задач.^[4][5][6]

Номенклатура рестриктаз

С момента их открытия в 1970-х годах было идентифицировано множество ферментов рестрикции; например, охарактеризовано более 3500 различных ферментов рестрикции типа II. Каждый фермент назван по имени бактерии, из которой он был выделен, с использованием системы наименований, основанной на роде, виде и штамме. Например, название фермента рестрикции EcoRI было получено, как показано в приведенной таблице:

Разбор названия рестриктазы EcoRI
Часть аббревиатуры	Значение	Что описывает
E	Escherichia	родовое название
co	coli	видовое название
R	RY13	штамм
I	Первая	порядок идентификации в бактерии

Изошизомеры, гетерошизомеры и изокаудомеры

Изошизомеры — это пары эндонуклеаз рестрикции, имеющих специфичность к распознаванию одинаковых последовательностей, но иногда отличающихся по наличию метилированных нуклеотидных остатков, и разрезающих эти последовательности в одинаковых местах. Например, изошизомерами являются рестриктазы Sph I (CGTAC^G) и Bbu I (CGTAC^G). Первый выделенный фермент для узнавания и специфического разрезания заданной последовательности, называют прототипом, а все остальные подобные рестриктазы называют изошизомерами.

Изошизомеры выделяют из разных штаммов бактерий и поэтому разные изошизомеры могут требовать разных условий реакции.

Гетерошизомеры (неошизомеры)

Фермент, узнающий такую же последовательность, но разрезающий её по-другому, называют гетерошизомером (неошизомером). Например, рестриктазы Sma I (GGG^CCC) и Xma I (G^GGCCC) являются гетерошизомерами, но не изошизомерами друг для друга.

Изокаудомеры

Эндонуклеазы рестрикции, распознающие совершенно разные последовательности, но образующие одинаковые концы, называют изокаудомерами.

Искусственные рестриктазы

В генной инженерии широко используются искусственные эндонуклеазы рестрикции, получаемые путём слияния ДНК-связывающего домена цинкового пальца с ДНК-разрезающим доменом нуклеазы^[7][8]. Домен цинкового пальца может быть спроектирован так чтобы узнавать и связываться с желаемой последовательностью ДНК^[9]. Альтернативой нуклеазам с цинковым пальцем являются искусственные ферменты рестрикции TALEN, получаемые путём слияния ДНК-связывающего домена TAL-эффектора с доменом расщепления ДНК^{[10][11][12][13]}.

Эндонуклеазы, работающие по «наводке» РНК

Для редактирования генома в клетках человека используются также эндонуклеазы системы CRISPR-Cas9, расщепляющие определённые последовательности ДНК по «наводке» комплементарной РНК^{[14][15][16][17][18][19]}. В отличие от цинковых пальцев и TALEN, системе CRISPR-Cas для узнавания ДНК требуется только создание соответствующей последовательности РНК «гида», а не создание новых белковых доменов фермента, что делает этот метод гораздо более доступным благодаря простоте и сравнительной дешевизне^{[20][21][22][23][24]}.

Перспективной видится разработка Fanzor – гомологов CRISPR-Cas9, обнаруженных у Spizellomyces punctatus^[25].

Значение

В практической молекулярной биологии чаще всего используются эндонуклеазы рестрикции II типа, сайт узнавания для которых в большинстве случаев представляет собой палиндром. Все эндонуклеазы рестрикции II типа — Mg²⁺-зависимы.

Эндонуклеазы рестрикции — часть сложной системы рестрикции-модификации, используемой бактериальными клетками для регуляции содержания и активности ДНК в клетке.

Открытие эндонуклеаз рестрикции в 1970-х годах вместе с разработкой способов секвенирования ДНК послужило основным толчком для развития генетической инженерии.

В настоящее время эндонуклеазы рестрикции с различными сайтами узнавания являются основным инструментом генетических исследований и генной инженерии.

См. также

• Система рестрикции-модификации
• Футпринтинг ДНК
• REBASE
• CRISPR-Cas13
• Хронология биотехнологии