Cas9 (англ.CRISPR associated protein 9, CRISPR-ассоциированный белок) — это управляемая при помощи РНК-гидов эндонуклеаза, связанная с адаптивной иммунной системой CRISPR (англ.Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) у ряда бактерий, в частности Streptococcus pyogenes. S. pyogenes использует Cas9 для запоминания[1], последующей проверки и разрезания чужеродной ДНК[2], например, ДНК бактериофагов или плазмид.
Кристаллическая структура S. aureus Cas9 в комплексе с сгРНК и её целевой ДНК в разрешении 2.6 A˚. (Nishimasu, et al. 2015)CRISPR/Cas9. Фиолетовым выделен участок гидовой РНК (gRNA) узнающий комплементарный участок-мишень на ДНК (выделен синим). PAM (выделен красным).
Cas9 выполняет проверку посредством раскручивания инородной ДНК и определения её комплементарности с двадцатью спаренными основаниями спейсерауправляющей РНК. Если субстрат комплементарен управляющей РНК, Cas9 расщепляет чужую ДНК. В этом смысле механизм CRISPR-Cas9 имеет ряд параллелей с механизмом РНК-интерференции (RNAi) у эукариот. Безопасность практического применения данного метода определяется в том числе и тем фактом, является ли искомая последовательность двадцати спаренных оснований уникальной в модифицируемой ДНК.
Механизм избирательного ингибирования транскрипции с помощью dCas9 путём стерического препятствияВарианты Cas9, которые связываются с ДНК, но не расщепляют её могут быть использованы для создания искусственных факторов транскрипции для избирательного регулирования транскрипционной активации и репрессии
Кроме изначальной функции в бактериальном иммунитете, белок Cas9 активно используют для создания точечных разрывов в двойной спирали ДНК, такие разрывы могут приводить к инактивации генов или созданию гетерологичных генов посредством соединения негомологичных концов и соответствующей гомологичной рекомбинации. Вместе с белками ZFN и TALEN, Cas9 становится значимым инструментом редактирования генома.[3]
Одним из первых продемонстрировал программируемое расщепление ДНК белком Cas9 литовский биохимик Виргиниюс Шикшнис, но его статья не была принята на рассмотрение журналом Cell Reports[англ.] 18 апреля 2012 года. Месяц спустя он отправил её в PNAS где на рассмотрение и публикацию ушло несколько месяцев[4]. Тем временем американский биохимик Дженнифер Даудна и французский микробиолог Эмманюэль Шарпантье опубликовали свою статью в рецензируемый научный журнал Science, где она была рассмотрена и принята в течение двух недель[4].
Вызывает удивление тот факт, что из-за патентных ограничений технология редактирования с помощью Cas9 доступна не ученым всего мира, а только владельцам патента, что является препятствием прогрессу науки, разработке лекарств для людей, живущих с серьёзными заболеваниями[6].
К 2012 году Cas9 приобрёл популярность, потому что он позволяет расщеплять практически любую нуклеотидную последовательность, комплементарную управляющей РНК[2]. Поскольку избирательность Cas9 является следствием комплементарности управляющей РНК и ДНК, а не модификации самого белка (в отличие от случаев TALEN и ZFN), для новых ДНК-мишеней возможна выработка специфических Cas9[7]. Варианты Cas9, которые связывают ДНК, но не расщепляют её (dCas9), могут быть использованы для доставки транскрипционных активаторов или репрессоров к специфичным последовательностям ДНК с целью регулирования транскрипционной активации и репрессии[8][9]. Хотя природный Cas9 требует составления управляющей РНК из двух в корне различных РНК — CRISPR-РНК (crRNA), и транс-активационную РНК (tracrRNA)[2], нацеливание Cas9 было упрощено при помощи выработки единой химерной управляющей РНК. Предполагается, что Cas9 можно будет использовать для изменения генома целых популяций организмов[10]. В 2015 году посредством Cas9 впервые был модифицирован геном человеческого эмбриона[11]. Разработана технология иммуногеномной инженерии гибридом, позволяющая быстро перепрограммировать специфичность их антител с помощью Cas9[12].
Создана технология, которая позволяет редактировать отдельные «буквы» ДНК и РНК, не разрезая цепь ДНК, а путём преобразования одного нуклеотидного основания в другое[13], что позволит лечить врожденные заболевания, вызванные точечными мутациями.[14][15][16]
Создана технология MAGESTIC (multiplexed accurate genome editing with short, trackable, integrated cellular barcodes), которая не только расщепляет ДНК, но ещё и доставляет к месту разрыва кусок ДНК необходимый для точной замены (с помощью гибридного связывающего ДНК белка LexA-Fkh1p), что повышает точность и эффективность редактирования[20][21]. Ещё одним инструментом для целевой вставки ДНК может стать CRISPR-ассоциированная транспозаза CAST (CRISPR-associated transposase) цианобактерии Scytonema hofmanni. ShCAST катализирует РНК-управляемую транспозицию ДНК путем однонаправленной вставки ниже протоспейсера сегментов ДНК размером в 60-66 пар нуклеотидов [22].
Соединив инактивированную молекулу dCas9, которая связывает ДНК, но не расщепляет её, с нуклеазой FokI, удаётся получить нуклеазы и рестриктазы для высокоселективного разрезания ДНК[23][24][25]. Разработан также способ избирательного эпигенетического перепрограммирования активности генов с помощью инактивированной молекулы dCas9, соединённой с ферментом, осуществляющим деметилирование ДНК[26]. Причём такое перепрограммирование эпигенома можно проводить даже in vivo[27][28]. Позднее выяснилось, что если укоротить управляющую РНК до 14-15 нуклеотидов, то молекула Cas9 теряет способность разрезать ДНК[29][30]. Используя это свойство удалось создать систему для избирательной активации определённых генов in vivo и проверить её эффективность путём лечения мышей со смоделированными заболеваниями[31]. У этого метода есть только одна проблема: обычно система CRISPR загружается в безвредный вирус, называемый аденоассоциированным вирусом (AAV), который переносит систему в клетку. Но весь белок, состоящий из dCas9 и направляющей РНК, слишком велик, чтобы поместиться в один AAV. Чтобы обойти эту проблему, исследователи загрузили dCas9 в один вирус, а управляющую РНК — в другой[31]. Созданы трансгенные линии мышей для направленной регуляции генов in vivo путем редактирования эпигенома с помощью систем dCas9p300 и dCas9KRAB. Эти линии мышей являются удобными инструментами для манипулирования экспрессией генов in vivo с помощью различных направляющих РНК.[32]
Использование системы Suntag позволяет нескольким антителам, слитым с активатором транскрипции VP64, связываться с dCas9-Suntag. Это, в свою очередь, задействует РНК-полимеразу и увеличивает экспрессию генов. смотри также рис 1 в ссылке[33]
Повысить эффективность молекулы dCas9 позволяет повторяющийся полипептидный массив из повторяющихся антигенов, называемый SunTag, который может привлекать несколько копий антител, связанных с ферментом, осуществляющим эпигенетическое редактирование, или же с носителем флуоресцентной метки.[34][33]
Основными требованиями к системе доставки Cas9 помимо высокой эффективности доставки является:
(1) конструкция синтезирующая Cas9 не должна встраиваться в геном клетки и не должна быть в клетке постоянно чтобы не мешать работе клетки и не спровоцировать иммунных реакций;
(2) средство доставки должно быть способно вместить достаточно большие по размерам фермент Cas9 или кодирующую его мРНК, а также одну или несколько направляющих РНК;
(3) оно должно быть удобно для использования в виде инъекций;
(4) такое средство вместе с Cas9 и направляющими РНК должно быть достаточно легко воспроизводимым для крупномасштабного производства лекарственного препарата для борьбы с распространенными болезнями.
Таким критериям в отличие от вирусных систем доставки, отвечают липидные наночастицы.[37][38] Так, например, была создана биодеградируемая система доставки Cas9 липидной наночастицей, которая позволила после однократного введения достичь in vivo более 97 % ингибирования уровня одного из белков сыворотки крови. При этом такое однократное введение, несмотря на временный характер системы доставки и компонентов системы редактирования, приводило к долговременному ингибированию продолжавшемуся в течение 12 месяцев[39]. Для доставки используют также внеклеточные везикулы[40]
Тем не менее продолжается разработка вирусных частиц для доставки Cas9 и sgРНК. Одной из таких разработок является NanoMEDIC (nanomembrane-derived extracellular vesicles for the delivery of macromolecular cargo)[41] NanoMEDIC эффективно индуцировал редактирование генома в различных типах клеток человека, таких как Т-клетки, моноциты, ИПСК, корковые нейроны, полученные из ИПСК, и миогенные клетки.
Поскольку существующие методы введения систем CRISPR-Cas в клетки с использованием вирусов-носителей и электрических импульсов, недостаточно эффективны для клеток, взятых непосредственно у пациентов (так называемых первичных клеток), предложено использовать комбинацию двух модифицированных пептидов, (одного из вируса ВИЧ и одного из вируса гриппа) облегчающую проникновение молекул CRISPR-Cas9 и Cas12a через внешнюю мембрану первичных клеток и в ядра, где находится большая часть клеточной ДНК. Это позволило сократить время инкубации и повысило эффективность редактирования генов до 98%[42]. Метод назван PAGE (Peptide-Assisted Genome Editing).
Легче переносить в клетки для редактирования генома более компактные белки Cas, поскольку они могут быть упакованы в небольшие по объёму средства доставки, такие как дезактивированный аденоассоциированный вирус (AAV). В качестве таких компактных белков можно использовать варианты Cas, обнаруженные в бактериофагах, например CRISPR-CasΦ, который вдвое меньше по молекулярной массе по сравнению с Cas9[43] или генноинженерный CasMINI, который несмотря на малые размеры, на клетках млекопитающих оказался столь же эффективен как и обычный
Cas, и при этом лучше проникает в клетки[44]
Модификация Cas9 путем её слияния с хроматин-модулирующими пептидами, полученными из белков группы высокой подвижности HMGN1 и HMGB1, гистонаH1 и комплексов ремоделированияхроматина, повышает её активность в несколько раз, особенно в отношении рефрактерных для неё участков хроматина. Эта стратегия слияния, называемая CRISPR-хром (англ. CRISPR-chrom), может быть использована для улучшения эффективности работы нуклеаз Cas9 при модификации генома[45].
Комплекс pegРНК с гибридным белком nCas9 (H840A) – обратная транскриптаза (RT), редактирующая с праймеромМеханика праймер опосредованного редактирования с Cas9 по Anzalone et al. (2019)[46] в модификации Geurts et al. (2021)[47]
CRISPR/Cas9 редактирование с праймером
dCas9-RT редактирование с праймером — в этом методе используется нуклеаза Cas9 (модифицированная в никазу, так что она может создавать разрыв только в одной цепи ДНК) соединённая с обратной транскриптазой (RT) и вместо обычной направляющей РНК используется так называемая pegРНК (prime editing guid RNA — с праймером редактирующая гид РНК). Этот метод, по мнению авторов, является более точным и универсальным, чем все разработанные до сих пор альтернативы CRISPR [46][48][49][47].
Модульная платформа SSSavi на основе dCas9 для комбинаторного редактирования эпигенома
Cистема SSSavi представляет собой сменную и реконфигурируемую стыковочную платформу, объединённую с dCas9, что позволяет одновременно задействовать до четырёх различных эффекторов, обеспечивая точный контроль состава эффекторов и их пространственного порядка. Пространственное предетерминированное упорядочение используемых эффекторов позволит более точно осуществлять регуляцию транскрипции.[50]
Исследователи разработали новый метод молекулярной визуализации с помощью РНК-направляемой эндонуклеазы CRISPR/dCas9 связанной с меткой. Технология позволила метить выбранные геномные последовательности в ядрах и хромосомах in situ. Метод назван RGEN-ISL. В отличие от классической флуоресцентной гибридизации in situ, RGEN-ISL не требует денатурации ДНК и, следовательно, обеспечивает лучшую сохранность структуры хроматина[51].
Аналогичную функцию выполняет генетический инструмент, названный CRISPR-HOT (CRISPR–Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis), для цветной маркировки определённых генов в органоидах человека[52][53][54].
CARTRIDGE (Cas-Responsive Translational Regulation Integratable into Diverse Gene control) технология использует белки Cas в качестве репрессоров и активаторовтрансляции в клетках млекопитающих.[55]
Cas12a
В отличие от Cas9 которая разрезает обе нити молекулы ДНК в одном и том же месте, оставляя тупые концы, Cas12a оставляет одну нить длиннее другой, создавая липкие концы длиной 4-5 нуклеотидов, что повышает эффективность генетических вставок и их специфичность.
Fanzor
Fanzor это программируемая РНК-управляемая эндонуклеаза эукариот — организмов, включающих грибы, растения и животных.
В отличие от белков CRISPR, ферменты эндонуклеазы Fanzor кодируются в эукариотическом геноме в составе мобильных элементов.[56][57].
Carlaw, T. M., Zhang, L. H., & Ross, C. J. (2020). CRISPR/Cas9 Editing: Sparking Discussion on Safety in Light of the Need for New Therapeutics. Human Gene Therapy, 31(15-16), 794-807. doi:10.1089/hum.2020.111
Mali Prashant, Esvelt Kevin M, Church George M.Cas9 as a versatile tool for engineering biology// Nature Methods.— 2013.— Vol.10.— P.957-963.— ISSN1548-7091.— doi:10.1038/nmeth.2649.
Gaudelli, N. M., Komor, A. C., Rees, H. A., Packer, M. S., Badran, A. H., Bryson, D. I., & Liu, D. R. (2017). Programmable base editing of A• T to G• C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 551(7681), 464-471. doi:10.1038/nature24644PMC5726555PMID29160308
Liu, Z., Chen, S., Shan, H., Jia, Y., Chen, M., Song, Y., ... & Li, Z. (2020). Precise base editing with CC context-specificity using engineered human APOBEC3G-nCas9 fusions. BMC biology, 18(1), 111 doi:10.1186/s12915-020-00849-6PMC7461344PMID32867757
Billon, P., Bryant, E. E., Joseph, S. A., Nambiar, T. S., Hayward, S. B., Rothstein, R., & Ciccia, A. (2017). CRISPR-mediated base editing enables efficient disruption of eukaryotic genes through induction of STOP codons. Molecular cell, 67(6), 1068-1079. doi:10.1016/j.molcel.2017.08.008PMC5610906PMID28890334
Kluesner, M. G., Lahr, W. S., Lonetree, C. L., Smeester, B. A., Claudio-Vázquez, P. N., Pitzen, S. P., ... & Webber, B. R. (2020). CRISPR-Cas9 cytidine and adenosine base editing of splice-sites mediates highly-efficient disruption of proteins in primary cells. bioRxiv. doi:10.1101/2020.04.16.045336
Levy, J. M., Yeh, W. H., Pendse, N., Davis, J. R., Hennessey, E., Butcher, R., ... & Liu, D. R. (2020). Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering, 4(1), 97-110. doi:10.1038/s41551-019-0501-5PMC6980783PMID31937940
Roy K. R., Smith J. D., Vonesch S. C., Lin G., Tu C. S., Lederer A. R., Chu A., Suresh S., Nguyen M., Horecka J., Tripathi A., Burnett W. T., Morgan M. A., Schulz J., Orsley K. M., Wei W., Aiyar R. S., Davis R. W., Bankaitis V. A., Haber J. E., Salit M. L., St Onge R. P., Steinmetz L. M.Multiplexed precision genome editing with trackable genomic barcodes in yeast.(англ.)// Nature Biotechnology.— 2018.— July(vol. 36, no. 6).— P. 512—520.— doi:10.1038/nbt.4137.— PMID29734294.[исправить]
Strecker J., Ladha A., Gardner Z., et al., (2019). RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science, eaax9181 doi:10.1126/science.aax9181
Xu, X.; Hulshoff, M.S.; Tan, X.; Zeisberg, M.; Zeisberg, E.M. CRISPR/Cas Derivatives as Novel Gene Modulating Tools: Possibilities and In Vivo Applications. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21(9), 3038; https://doi.org/10.3390/ijms21093038
Gemberling, M., Siklenka, K., Rodriguez, E., Eisinger, K., Barrera, A., Liu, F., ... & Gersbach, C. (2021). Transgenic mice for in vivo epigenome editing with CRISPR-based systems. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2021.03.08.434430
Morita, S., Horii, T., Kimura, M., & Hatada, I. (2020). Synergistic Upregulation of Target Genes by TET1 and VP64 in the dCas9–SunTag Platform. International journal of molecular sciences, 21(5), 1574. doi:10.3390/ijms21051574PMC7084704PMID32106616
Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., & Vale, R. D. (2014). A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell, 159(3), 635-646. doi:10.1016/j.cell.2014.09.039PMC4252608PMID25307933
Li, J., Mahata, B., Escobar, M. et al. (2021). Programmable human histone phosphorylation and gene activation using a CRISPR/Cas9-based chromatin kinase. Nat Commun 12, 896, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21188-2
Wang, M., Zuris, J. A., Meng, F., Rees, H., Sun, S., Deng, P., ... & Xu, Q. (2016). Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences, 113(11), 2868-2873.
Qiu, M., Glass, Z., Chen, J., Haas, M., Jin, X., Zhao, X., ... & Xu, Q. (2021). Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences, 118(10). PMID33649229doi:10.1073/pnas.2020401118
Horodecka, K., & Düchler, M. (2021). CRISPR/Cas9: Principle, Applications, and Delivery through Extracellular Vesicles. International Journal of Molecular Sciences, 22(11), 6072. PMID34199901PMC8200053doi:10.3390/ijms22116072
Zhang, Z., Baxter, A. E., Ren, D., Qin, K., Chen, Z., Collins, S. M., ... & Shi, J. (2023). Efficient engineering of human and mouse primary cells using peptide-assisted genome editing. Nature Biotechnology, 1-11. PMID37095348doi:10.1038/s41587-023-01756-1
Pausch P., Al-Shayeb1 B., Bisom-Rapp E, et al. (2020). CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor. Science. 369(6501), 333-337 doi:10.1126/science.abb1400
Xiaoshu Xu, Augustine Chemparathy, Leiping Zeng, Hannah R. Kempton, Stephen Shang, Muneaki Nakamura, Lei S. Qi, (2021). Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing, Molecular Cell, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.008.
Anzalone, A. V., Randolph, P. B., Davis, J. R., Sousa, A. A., Koblan, L. W., Levy, J. M., ... & Liu, D. R. (2019). Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature, 1-1. doi:10.1038/s41586-019-1711-4
Geurts, M. H., de Poel, E., Pleguezuelos-Manzano, C., Oka, R., Carrillo, L., Andersson-Rolf, A., ... & Clevers, H. (2021). Evaluating CRISPR-based prime editing for cancer modeling and CFTR repair in organoids. Life Science Alliance, 4(10). PMID34373320doi:10.26508/lsa.202000940
Ledford, H. (2019). Super-precise new CRISPR tool could tackle a plethora of genetic diseases. Nature, 574(7779), 464-465 doi:10.1038/d41586-019-03164-5
Монография (2020). “Методы редактирования генов и геномов”. под ред. С.М. Закияна, С.П. Медведева, Е.В. Дементьевой, В.В. Власова. Монография состоит из 26 глав, в которых авторы детально описывают протоколы применения CRISPR‐опосредованных систем для модификации геномов различных организмов: от дрожжей до культивируемых клеток человека.
Гоглева А. А., Артамонова И. И. (2014). CRISPR-системы: структура и гипотетические функции. Природа 6 (2014), 16-21;
Гоглева А. А., Артамонова И. И. (2014). CRISPR-системы: механизм действия и применения. Природа 7 (2014), 3-9.
Asmamaw, M., & Zawdie, B. (2021). Mechanism and Applications of CRISPR/Cas-9-Mediated Genome Editing. Biologics: Targets & Therapy, 15, 353. PMID34456559PMC8388126doi:10.2147/BTT.S326422
Boti, M. A., Athanasopoulou, K., Adamopoulos, P. G., Sideris, D. C., & Scorilas, A. (2023). Recent Advances in Genome-Engineering Strategies. Genes, 14(1), 129; https://doi.org/10.3390/genes14010129
Nuñez, J. K., Chen, J., Pommier, G. C., Cogan, J. Z., Replogle, J. M., Adriaens, C., ... & Weissman, J. S. (2021). Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell, 184(9), 2503-2519. PMID33838111PMC8376083doi:10.1016/j.cell.2021.03.025
Bravo, J.P.K., Liu, MS., Hibshman, G.N. et al. (2022). Structural basis for mismatch surveillance by CRISPR–Cas9. Nature. doi:10.1038/s41586-022-04470-1 Новая версия фермента названная SuperFi-Cas9 в 4000 раз реже вносит ошибочные (не целевые) разрезы, но при этом работает так же быстро, как природный Cas9.
Liu, H., Wang, L., & Luo, Y.Blossom of CRISPR technologies and applications in disease treatment(англ.)// Synth Syst Biotechnol: journal.— 2018.— Vol. 3, no. 4.— P. 217—228.— doi:10.1016/j.synbio.2018.10.003.— PMID30370342.
Li, B., Niu, Y., Ji, W., & Dong, Y.Strategies for the CRISPR-Based Therapeutics(англ.)// Trends in Pharmacological Sciences: journal.— 2020.— Vol. 41, no. 1.— P. 55-65.— doi:10.1016/j.tips.2019.11.006.
CRISPR: gene editing is just the beginning. The real power of the biological tool lies in exploring how genomes work. Nature 531, 156—159 (10 March 2016) doi:10.1038/531156a(на англ.) Обзор разных способов применения Cas9. Хорошие иллюстрации.
CRISPR-Cas: A Laboratory Manual Edited by Jennifer Doudna, University of California, Berkeley; Prashant Mali, University of California, San Diego
Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., & Zhang, F.Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity(англ.)// Science: journal.— 2016.— Vol. 351, no. 6268.— P. 84—88.— doi:10.1126/science.aad5227.
Kleinstiver B. P., Pattanayak V., Prew M. S., & J. Keith Joung et al.High-fidelity CRISPR–Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects(англ.)// Nature: journal.— 2016.— doi:10.1038/nature16526.
Mandegar M. A., Huebsch N., Frolov E. B., & Conklin B. R. et al.CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs(англ.)// Cell Stem Cell[англ.]: journal.— 2016.— doi:10.1016/j.stem.2016.01.022.
Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., & Liu, D. R.Small molecule–triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity(англ.)// Nature chemical biology: journal.— 2015.— Vol. 11, no. 5.— P. 316—318.— doi:10.1038/nchembio.1793.
Zetsche, B., Volz, S. E., & Zhang, F.A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation(англ.)// Nature biotechnology: journal.— 2015.— Vol. 33, no. 2.— P. 139—142.— doi:10.1038/nbt.3149.
Zlotorynski, E.Genome engineering: Structure-guided improvement of Cas9 specificity(англ.)// Nature Reviews Molecular Cell Biology: journal.— 2016.— P. 3—3.
Heidi Ledford.A powerful gene-editing technology is the biggest game changer to hit biology since PCR. But with its huge potential come pressing concerns.(англ.)// NATURE: journal.— 2015.— Vol. 522.— P. 20—24.— doi:10.1038/522020a.
Amanda Andersson-Rolf, & Bon-Kyoung Koo et al.One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.(англ.)// Nature Methods: journal.— 2017.— doi:10.1038/nmeth.4156.CRISPR-FLIP, a strategy that provides an efficient, rapid and scalable method for biallelic conditional gene knockouts in diploid or aneuploid cells.
Wang, D., Zhang, F., & Gao, G. (2020). CRISPR-Based Therapeutic Genome Editing: Strategies and In Vivo Delivery by AAV Vectors. Cell, 181(1), 136-150. PMID32243786doi:10.1016/j.cell.2020.03.023
Timothy R. Abbott, Girija Dhamdhere, Yanxia Liu et al., (2020). Development of CRISPR as an Antiviral Strategy to Combat SARS-CoV-2 and Influenza. Cell https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.020
Xie H, Ge X, Yang F, Wang B, Li S, Duan J, et al. (2020). High-fidelity SaCas9 identified by directional screening in human cells. PLoS Biol 18(7): e3000747. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000747
Horodecka K, Düchler M. CRISPR/Cas9: Principle, Applications, and Delivery through Extracellular Vesicles. International Journal of Molecular Sciences. 2021; 22(11):6072. https://doi.org/10.3390/ijms22116072
Denes CE, Cole AJ, Aksoy YA, Li G, Neely GG, Hesselson D. (2021). Approaches to Enhance Precise CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing. International Journal of Molecular Sciences. 22(16):8571. https://doi.org/10.3390/ijms22168571
Pan, C., Wu, X., Markel, K. et al. (2021). CRISPR–Act3.0 for highly efficient multiplexed gene activation in plants. Nat. Plants https://doi.org/10.1038/s41477-021-00953-7
Park, J., Yoon, J., Kwon, D., Han, M. J., Choi, S., Park, S., ... & Choe, S. (2021). Enhanced genome editing efficiency of CRISPR PLUS: Cas9 chimeric fusion proteins. Scientific Reports, 11(1), 1-9. PMID34376729PMC8355345doi:10.1038/s41598-021-95406-8
Corsi, G. I., Gadekar, V. P., Gorodkin, J., & Seemann, S. E. (2021). CRISPRroots: on-and off-target assessment of RNA-seq data in CRISPR–Cas9 edited cells. Nucleic Acids Research, 50(4), e20 PMID34850137doi:10.1093/nar/gkab1131
Nambiar, T. S., Baudrier, L., Billon, P., & Ciccia, A. (2022). CRISPR-based genome editing through the lens of DNA repair. Molecular Cell, 82(2), 348-388. PMID35063100PMC8887926 (available on 2023-01-20) doi:10.1016/j.molcel.2021.12.026
Amendola, M., Brusson, M., & Miccio, A. CRISPRthripsis: The Risk of CRISPR/Cas9-induced Chromothripsis in Gene Therapy. Stem Cells Translational Medicine, 11(10), 1003–1009 PMID36048170PMC9585945doi:10.1093/stcltm/szac064
Carusillo, A., Haider, S., Schäfer, R., Rhiel, M., Türk, D., Chmielewski, K. O., ... & Mussolino, C. (2023). A novel Cas9 fusion protein promotes targeted genome editing with reduced mutational burden in primary human cells. Nucleic Acids Research, 51(9), 4660-4673. PMID37070192PMC10201422doi:10.1093/nar/gkad255
Tyumentseva, M., Tyumentsev, A., & Akimkin, V. (2023). CRISPR/Cas9 Landscape: Current State and Future Perspectives. International Journal of Molecular Sciences, 24(22), 16077. doi:10.3390/ijms242216077
Karpov, D. S. (2024). CRISPR-Cas Systems and Genome Editing: Beginning the Era of CRISPR/Cas Therapies for Humans. International Journal of Molecular Sciences, 25(10), 5292. doi:10.3390/ijms25105292