DNA-mikromatrise
måleteknologi From Wikipedia, the free encyclopedia
måleteknologi From Wikipedia, the free encyclopedia
DNA-mikromatrise er en teknologi som brukes innen molekylærbiologi og medisin for å måle mengden av bestemte DNA-fragmenter i en biologisk prøve. Teknologien utnytter det at DNA har to tråder eller strenger som er komplementære. Komplementariteten betyr at dersom man har den ene strengen, så kan man alltid utlede den andre. Disse to trådene binder seg til hverandre ved hybridisering, og dette blir utnyttet i mikromatriseteknologien. Fragmenter fra en av DNA-trådene til for eksempel et gen eller en annen del av DNA som man ønsker å måle, festes til mikromatrisen. Disse fragmentene kalles prober. Probene er små, og en mikromatrise kan inneholde fra noen titalls tusen til noen få millioner prober. For å måle genuttrykk i humane prøver brukes prober for alle de ca. 22 000 proteinkodende genene i mennesker. Selve mikromatrisen er vanligvis en fast overflate av glass eller en nylon-membran. Andre typer mikromatriser, som Illumina, bruker mikroskopiske kuler som sitter i små brønner i stedet for den faste overflaten.
Fragmentene man ønsker å måle mengden av varierer etter hva målet med forsøket er. Dersom man er interessert i genuttrykket isoleres mRNA, som så blir reverstranskibert til cDNA. cDNAet blir vanligvis farget med en rød eller grønn fluoreserende farge før de tømmes på mikromatrisen. Her flyter de rundt til de finner sin komplementære probe på matrisen og binder seg fast. Det cDNA som ikke fester seg blir så vasket bort før matrisen skannes. Under skanningen sender man lys ned på matrisen, som gjør at de fluoreserende molekylene lyser opp. Styrken på lyssignalet gir et mål på mengden av cDNA som har bundet seg.
Der finnes mange forskjellige typer mikromatriser. DNA-mikromatriser skiller seg fra de andre typene ved at de bruker DNA som deteksjonssystem.
DNA-mikromatriseteknologien er sprunget ut fra Southern blot, som er en molekylærbiologisk metode som brukes til å påvise bestemte DNA-fragmenter i en prøve. Den første samlingen av spesifikke DNA-fragmenter brukt til profilering av genuttrykk ble beskrevet i 1987 [1] i en studie hvor de ønsket å identifiserte gener hvis genuttrykk moduleres av interferon. De første DNA-mikromatrisene ble laget ved å trykke cDNA ned på filterpapir. De første mikromatrisene for profilering av genuttrykk ble rapportert i 1995 [2], og komplett eukaryotisk genom (Saccharomyces cerevisiae) på en mikromatrise ble publisert i 1997. [3]
DNA-mikromatriser kan brukes til å detektere DNA (som i Comparativ Genomic Hybridisation) eller RNA (som regel cDNA etter reverstranskripsjon).
Siden en mikromatrise inneholder titusener av prober gjør man i praksis titusener av tester parallelt. Mikromatrisene har derfor ført til at det er mulig å se sammenhenger mellom forskjellige gener som det ikke var mulig å oppdage tidligere. DNA-mikromatriser har i tillegg akselerert mange typer metoder:
| Metode | Sammendrag |
|---|---|
| Genuttrykksmatriser | Mengden mRNA fra tusenvis av gener måles parallelt. Disse matrisene brukes til å studere endring i genuttrykket ved forskjellige behandlinger, som resultat av sykdom eller endringer ved ulike utviklingsstadier. For eksempel så kan matrisebasert genuttrykksprofilering brukes til å identifisere hvilke gener som endres som en respons av infeksjon, ved å sammenligne genuttrykket i infiserte og uinfiserte celler. |
| MikroRNA-matriser | I funksjon lik genuttrykksmatriser, men måler mikroRNA i stedet for kodende gener. Uttrykksprofiler av
mikroRNA kan analyseres eller sammen med genuttrykksdata for å måle mikroRNAets påvirkning på transkripsjon. |
| Comparative genomic hybridisation (CGH) | Sammenligne genomet av forskjellige celler eller nært beslektede organismer for å finne forskjeller. Mer spesifikt ser man etter innsatte og slettede områder i genomet. Dette gir seg uttrykk i endringer i kopitall[4][5]. For eksempel så kan man identifisere genomiske ubalanser ved å sammenligne DNA fra pasient med DNA fra en frisk kontroll. |
| Tiling | Tiling matriser inneholder overlappende prober som er laget for å representere et interessant genomisk område så godt som mulig. Noen gangen kan det interessante området dekke et helt kromosom. Målet med disse matrisene er å kunne identifisere ukjente transkript, alternative spleisevarianter og bindeseter for proteiner. |
| Kromatin immunoutfelling | Disse matrisene (ofte referert til som ChIP chip) brukes til å identifisere hvilke steder på DNA som bindes av et bestemt protein, feks en transkripsjonsfaktor. DNA fragmentene som er bundet av proteinet isoleres og hybridiseres til feks en tiling eller en promotor matrise. |
| SNP-deteksjon | Identifisere enkle nukleotidpolymorfismer blant alleler innen og mellom populasjoner. SNP analyse brukes innenfor mange områder som genotyping, rettsmedisin, predisposisjon for sykdom, evaluere arvelige mutasjoner i individer, eller somatiske mutasjoner i kreftceller, genetiske linkage studier og så videre. |
| Alternativ spleising | Matriser med prober som er designet for å oppdage forventede eller potensielle spleiseposisjoner. Matrisene har ofte prober som ligger tettere enn genuttrykksmatrisene, men ikke så tette som tilingmatrisene. Eksonmatriser kan og brukes til å detektere spleisevarianter, men probene på disse matrisene er først og fremst designet for å identifisere individuelle ekson |
| Fusjonsgen-mikromatrise | Disse matrisene brukes til å identifisere Fusjonsgener. Prinsippene bak matrisene bygger på de samme prinsippene som matrisene brukt til å studere alternativ spleising. |
Anvendelse av mikromatriser i forskningen har skapt flere statistiske og bioinformatiske utfordringer:
Kompleksiteten av genuttryksdata gjør at det er viktig å planlegge forsøket nøye for at det skal være mulig å dra biologiske slutninger som er statistisk gyldige. Mye av grunnen til dette er en sensitiv teknologi sammen med mengden data som gjør at systematiske støy i dataene blir tydeligere. Eksperimentell planlegging i denne sammenhengen er svært omfattende og dekker alt fra design av prober og produksjon av matrisene til prøvebehandling, prøvetaking, rensing av RNA samt stegene som omfatter selve mikromatriseforsøket.
Sammenligning av resultater fra forskjellige mikromatriseforsøk kan ofte by på store utfordringer på grunn av manglende standarder både når det gjelder produksjon av matriser, protokoller brukt under forsøket, og et hav av analysemetoder som kan brukes i etterkant. Dette byr på bioinformatiske utfordringer og flere prosjekter er satt igang for gjøre det lettere å utveksle data, samt analysere data som kommer fra forskjellige plattformer:
Før man analyserer data fra forskjellige fysiske mikromatriser må man som regel normalisere dataene for å sikre at de er sammenlignbare. Der er flere måter å normalisere dataene på, og det kan noen ganger være vanskelig å vite hvilke metoder som er best å bruke. Dersom man har brukt det som kalles "Spike-ins", som er eksternt DNA fra feks plante dersom man jobber med DNA fra menneske eller dyr, så kan man se på hvordan dataene fra dette DNAet oppfører seg under diverse normaliseringsmetoder. Man tilsetter det eksterne DNAet i kjente mengder, sånn at det er mulig å sammenligne på tvers av mikromatriser.
Når man gjør statistiske analyser beregnes ofte en p-verdi som sier noe om sannsynligheten for å få dette resultatet ved en tilfeldighet. Normalt sett gjør man noen få tester om gangen. Det som er litt spesielt når det gjelder de statistiske analysene av mikromatrisedata er at man gjør mange tester samtidig. Når man gjør mange tester så øker sannsynligheten for at man gjør et funn, helt tilfeldig. P-verdiene blir derfor ofte justert for å ta høyde for multippel testing problematikken.
Forholdet mellom probene og genene de er forventet å detektere kan være noe problematisk. Noen mRNA molekyler kan binde seg til flere prober enn de er tenkt å hybridisere til. Dette kalles krysshybridisering. Disse mRNA molekylene vil da bidra til signal for prober som egentlig er ment å skulle detektere et helt annet mRNA molekyl.
De to viktigste datavarehusene for mikromatrisedata er ArrayExpress og Gene Expression Omnibus (GEO). Begge disse har funksjoner som gjør det mulig å søke etter bestemte gener på tvers av forskjellig mikromatriseforsøk, eller man kan laste ned dataene som er brukt i forskjellige publikasjoner for å se om man greier å reprodusere selve analysen. Mange tidsskrifter krever at dataene gjøres offentlig tilgjengelig, og da ofte at de gjøres tilgjengelig gjennom en av disse datavarehusene.
Seamless Wikipedia browsing. On steroids.
Every time you click a link to Wikipedia, Wiktionary or Wikiquote in your browser's search results, it will show the modern Wikiwand interface.
Wikiwand extension is a five stars, simple, with minimum permission required to keep your browsing private, safe and transparent.
