Idrogenasi

Una idrogenasi è un enzima che catalizza l'ossidazione reversibile di idrogeno molecolare (H₂), come mostrato in seguito:

1. H₂ + A_ox → 2H⁺ + A_red
2. 2H⁺ + D_red → H₂ + D_ox

Il consumo di idrogeno (1) è accoppiato alla riduzione di accettori di elettroni quali ossigeno, nitrato, solfato, anidride carbonica e fumarato. D'altra parte, la riduzione dei protoni (2) è accoppiata all'ossidazione dei donatori di elettroni quali ferredossina (FNR), e serve a smaltire gli elettroni in eccesso nelle cellule (essenziale nella fermentazione del piruvato). Sia composti a basso peso molecolare sia proteine come FNR, citocromoc₃ e citocromo c₆ possono agire come donatori o accettori fisiologici di elettroni per l'idrogenasi.^[1]

Classificazione strutturale

Struttura dei siti attivi dei tre tipi di idrogenasi, rappresentate mediante proiezione a cuneo e tratteggio.

Le idrogenasi sono classificate in base a quale dei seguenti tre tipi di atomi metallici costituiscono il sito attivo: [NiFe], [FeFe] e [Fe]-only. Fino al 2004 si pensava che l'idrogenasi [Fe]-only fosse priva di atomi metallici (metal-free). Poi, Thauer e colleghi hanno dimostrato che le idrogenasi metal-free in realtà contengono un atomo di ferro nel loro sito attivo.^[2] Queste proteine contengono solo un sito [Fe] attivo e senza centri ferro-zolfo, in contrasto con le idrogenasi [FeFe]. Le idrogenasi [NiFe] e [FeFe] hanno alcune caratteristiche comuni nella loro struttura: ogni enzima ha un sito attivo e alcuni centri Fe-S che sono racchiusi nella proteina. Il sito attivo, che è luogo dove avviene la catalisi, è anche un metallocluster, e ogni metallo è coordinato dai ligandi monossido di carbonio (CO) e cianuro (CN^-).^[3]

Idrogenasi [NiFe]

Struttura cristallina della idrogenasi [NiFe]

Le idrogenasi [NiFe] sono proteine eterodimeriche costituite da una subunità piccole (S) e una grande (L). La subunità S contiene tre cluster ferro-zolfo mentre la subunità L contiene il sito attivo: un centro nichel-ferro che è collegato al solvente da un tunnel molecolare.^[4] In alcune idrogenasi [NiFe] uno dei residui di cisteina che normalmente coordinano il nichel è sostituita da selenocisteina. Sulla base della similarità di sequenza, tuttavia, le idrogenasi [NiFe] e [NiFeSe] devono essere considerate una singola superfamiglia. Ad oggi sono stati trovate idrogenasi periplasmatiche, citoplasmatiche, e citoplasmatiche legate alla membrana. Le idrogenasi [NiFe], quando isolate, si trovano a catalizzare sia l'evoluzione sia l'assorbimento di H₂, tramite l'azione di citocromi multieme a basso potenziale quali il citocromo c₃, che agiscono sia come donatori sia come accettori di elettroni, a seconda del loro stato di ossidazione. In generale, tuttavia, le idrogenasi [NiFe] sono più attive nell'ossidare H₂. Come le idrogenasi [FeFe], le [NiFe] sono note per essere inattivate da ossigeno molecolare (O₂). Nel 2005 è stato scoperto che una nuova idrogenasi derivante da Ralstonia eutropha sembra essere tollerante all'ossigeno.^[5] Questa scoperta ha aumentato la speranza che le idrogenasi possano essere usate nella produzione di idrogeno molecolare tramitescissione dell'acqua, in un processo di fotosintesi artificiale.

Idrogenasi [FeFe]

Struttura cristallina della idrogenasi [FeFe]

Le idrogenasi contenenti cluster Fe-S o nessun altro atomo metallico oltre al ferro sono chiamati idrogenasi [FeFe].^[6] Sono note tre famiglie di questo tipo di idrogenasi:

• idrogenasi citoplasmatiche, solubili e monomeriche, trovate in organismi anaerobi stretti come Clostridium pasteurianum e Megasphaera elsdenii . Esse sono estremamente soggette ad inattivazione da parte dell'ossigeno molecolare e catalizzano sia l'evoluzione che l'assorbimento di idrogeno molecolare.
• idrogenasi periplasmatiche ed eterodimeriche presenti in varie specie di Desulfovibrio, che possono essere purificate in presenza di ossigeno e catalizzano principalmente l'ossidazione di H₂ .
• idrogenasi solubili e monomeriche, che si trovano nei cloroplasti dell'alga verde Scenedesmus obliquus, e che catalizzano l'evoluzione di H₂. La ferredossina Fe₂S₂] agisce come donatore naturale di elettroni, agendo da ponte tra l'enzima e la catena di trasporto degli elettroni fotosintetica.

In contrasto alle idrogenasi [NiFe], le [FeFe] sono generalmente più attive nella produzione di idrogeno molecolare. In letteratura sono riportate frequenze di turnover (TOF) nell'ordine di 10.000 s^-1 per l'idrogenasi [FeFe] d Clostridium pasteurianum.^[7] Ciò ha portato ad un'intensa attività di ricerca con particolare attenzione all'uso di idrogenasi [FeFe] per la produzione sostenibile di H₂.^[8]

Idrogenasi [Fe]-only

Struttura cristallina della idrogenasi [Fe]

L'idrogenasi [Fe]-only chiamata 5,10-meteniltetraidrometanopterina idrogenasi (EC 1.12.98.2), ritrovata negli Archaea metanogeni, non include né nichel né cluster ferro-zolfo ma un cofattore (5,10-meteniltetraidrometanopterina o 5,10-metenil-THMPT) contenente ferro che è stato caratterizzato tramite diffrazione dei raggi X.^[9]

A differenza degli altri due tipi, queste idrogenasi si trovano solo in alcuni i archeobatteri metanogenici idrogenotrofi. Sono inoltre dotate di un meccanismo enzimatico fondamentalmente diverso in termini di partner redox e di come gli elettroni vengono condotti al sito attivo. Nelle idrogenasi [NiFe] e [FeFe] gli elettroni viaggiano attraverso una serie di cluster organometallici che coprono una distanza relativamente lunga; durante tutto il processo le strutture del sito attivo rimangono inalterate. Nelle idrogenasi [Fe]-only, tuttavia, gli elettroni vengono consegnati direttamente al sito attivo lungo un percorso che copre una breve distanza. Il cofattore metenil-THMPT⁺ accetta direttamente l'idruro (H^-) nel processo. Queste idrogenasi sono anche conosciute come metilene-THMPT deidrogenasi formanti H₂, poiché la sua funzione è la riduzione reversibile della metenil-THMPT⁺ a metilene-THMPT.^[10] L'idrogenazione di una metenil-THMPT⁺ avviene nel modo inverso alla produzione di idrogeno, che è il caso che si verifica per gli altri due tipi di idrogenasi. Sebbene il meccanismo esatto della catalisi sia ancora in studio sembra evidente che avvenga innanzitutto la scissione eterolitica dell'idrogeno molecolare da parte del Fe(II), quindi avvenga il trasferimento dell'idruro al carbocatione dell'accettore.^[11]

Meccanismo di azione

Il meccanismo molecolare con il quale protoni vengono convertiti in molecole di idrogeno dall'idrogenasi è ancora in corso di studio. Un approccio comune per studiare il meccanismo molecolare impiega la mutagenesi al fine di chiarire il ruolo di particolari amminoacidi e ligandi in diverse fasi della catalisi, ad esempio durante il trasporto intramolecolare di substrati. Per esempio, Cornish e colleghi ha condotto scoperto tramite mutagenesi che quattro amminoacidi, situati lungo il canale putativo che collega il sito attivo e la superficie dell'enzima, sono fondamentali per la funzione enzimatica delle idrogenasi [FeFe] di Clostridium pasteurianum.^[12] D'altra parte, si può anche contare su analisi di calcolo e simulazioni: Nilsson e Lill Siegbahn hanno adottato questo approccio per indagare il meccanismo con cui le idrogenasi [NiFe] catalizzano la scissione di idrogeno molecolare.^[13] I due approcci sono complementari e possono beneficiare l'uno dell'altro. Infatti, Cao e Hall hanno combinato entrambi gli approcci per sviluppare il modello che descrive come le molecole di idrogeno sono ossidate o prodotte all'interno del sito attivo delle idrogenasi [FeFe].^[14] Sebbene ad oggi siano necessari più dati sperimentali per delucidare il meccanismo che sta alla base della catalisi, questi risultati hanno permesso agli scienziati di applicare queste conoscenze, ad esempio, alla costruzione di catalizzatori artificiali che imitano i siti attivi di delle idrogenasi.^[15]

Funzione biologica

Supponendo che l'atmosfera della Terra fosse inizialmente ricca di idrogeno, gli scienziati ipotizzano che le idrogenasi si siano evolute per produrre energia a partire da (o sotto forma di) idrogeno molecolare. Di conseguenza, le idrogenasi possono aver favorito la proliferazione di microrganismi in simili condizioni ambientali o persino aver peremsso ad interi ecosistemi di basarsi sull'idrogeno.^[16] Nelle profondità marine, dove altre forme di energia come la luce solare non sono disponibili, sono state individuate comunità di microrganismi il cui metabolismo è basato sulla sintesi di idrogeno molecolare. Sulla base di queste osservazioni sembra che il ruolo primario delle idrogenasi sia la generazione di energia, sia per se stessi sia per gli altri organismi all'interno di una comunità.

Le idrogenasi hanno anche altre funzioni, di più recente scoperta: idrogenasi bidirezionali possono anche fungere da "valvole" per regolare l'eccesso di equivalenti riducenti, soprattutto in microrganismi fotosintetici. Tale ruolo investe le idrogenasi di un ruolo fondamentale nel metabolismo anaerobico.^[17][18] Inoltre, le idrogenasi possono anche essere coinvolte nell'immagazzinamento di energia mediato da membrane attraverso la generazione di una forza proton-motrice transmembrana.^[16] Vi è anche la possibilità che idrogenasi siano responsabili del biorisanamento di composti clorurati. Le idrogenasi in grado di rimuovere H₂ possono aiutare il recupero di contaminanti metallici in forme non tossiche. È interessante notare che queste idrogenasi in grado di assorbire idrogeno sono state individuate anche in batteri patogeni e parassiti, nei quali si ritiene che tali anzimi siano coinvolti nella loro virulenza.^[16]

Applicazioni

Le idrogenasi sono state scoperte nel 1930,^[19] e da allora hanno attirato l'interesse di molti ricercatori, tra cui i chimici inorganici che hanno sintetizzato una serie di idrogenasi strutturalmente simili a quelle naturali. Comprendere il meccanismo catalitico delle idrogenasi potrebbe aiutare gli scienziati a progettare fonti di energia pulita di origine biologica (basate ad esempio su alghe) che producono idrogeno.^[20]

Produzione biologica di idrogeno

Lo stesso argomento in dettaglio: Produzione biologica di idrogeno.

Vari sistemi sono in grado di scindere l'acqua in O₂ e H⁺ a partire dalla luce solare incidente. Allo stesso modo numerosi catalizzatori, sia chimici o biologici, sono in grado di ridurre l'H⁺prodotto in H₂. Catalizzatori diversi richiedono sovrapotenziali differenti per far avvenire la reazione. Le idrogenasi sono interessanti in quanto richiedono un sovrapotenziale relativamente basso: la loro attività catalitica è infatti più efficace del platino, che è il migliore catalizzatore noto per le reazioni che sviluppano H₂.^[21] Fra i tre diversi tipi di idrogenasi, le idrogenasi [FeFe] sono considerate come le migliori candidate per avere un ruolo in sistemi di produzione di H₂ a partire dalla luce solare in quanto offrono un'ulteriore vantaggio grazie all'elevato turnover(maggiore di 9000 s^-1).^[7] La bassa attività catalitica e il basso sovrapotenziale tipico delle idrogenasi di tipo [FeFe] sono accompagnati da un'alta sensibilità all'ossigeno molecolare. Per utilizzare questo tipo di idrogenasi nella produzione solare di H₂ è necessario progettare delle idrogenasi tolleranti all'ossigeno, in quanto l'O₂ è un sottoprodotto della reazione di scissione dell'acqua. Inizialmente, gli sforzi di ricerca dei vari gruppi di tutto il mondo si sono concentrati sulla comprensione dei meccanismi coinvolti nell'inattivazione delle idrogenasi da parte dell'ossigeno.^[22][23] Ad esempio, Stripp e colleghi si sono concentrati sullo studio di pellicole elettrochimiche di proteine, scoprendo che l'ossigeno viene dapprima convertito in una specie reattive a livello del sito attivo dell'idrogenasi [FeFe], danneggiando il dominio [4Fe-4S].^[24] Cohen e colleghi hanno studiato come l'ossigeno può raggiungere il sito attivo (che è sepolto all'interno del corpo della proteine) attraverso un approccio di simulazione dinamica molecolare. I loro risultati indicano che l'O₂ diffonde principalmente attraverso due percorsi che si formano per ampliamento e interconnessione tra le cavità dell'enzima durante i movimenti dinamici che l'enzima subisce durante la sua attività.^[25] Questi studi, in combinazione con altri risultati, suggeriscono che l'inattivazione è regolata da due fenomeni: la diffusione di O₂ a livello del sito attivo e la conseguente modifica distruttiva del sito attivo stesso.

Nonostante queste scoperte sono ancora in corso di studio le tecniche di ingegnerizzazione dell'enzima per renderlo tollerante all'ossigeno. I ricercatori hanno individuato delle idrogenasi di tipo [NiFe] tolleranti all'ossigeno, tuttavia questi enzimi sono efficienti solo nell'assorbimento dell'idrogeno e non nella sua produzione.^[22]

Classificazione biochimica

EC 1.2.1.2 idrogeno deidrogenasi (idrogeno:NAD⁺ ossidoreduttasi)

H₂ + NAD⁺ = H⁺ + NADH

EC 1.12.1.3 idrogeno deidrogenasi (NADP+) (idrogeno:NADPH⁺ ossidoreduttasi)

H₂ + NADP⁺ = H⁺ + NADPH

EC 1.12.2.1 citocromo-c₃ idrogenasi (idrogeno:ferricitocromo-c₃ ossidoreduttasi)

2H₂ + ferricitocromo c₃ = 4H⁺ + ferrocitocromo c₃

EC 1.12.7.2 ferredossina idrogenasi (idrogeno:ferredossina ossidoreduttasi)

H₂ + ferredossina ossidata = 2H⁺ + ferredossina ridotta

EC 1.12.98.1 coenzima F₄₂₀ idrogenasi (idrogeno:coenzima F₄₂₀ossidoreduttasi)

H₂ + coenzima F₄₂₀ = coenzima F₄₂₀ ridotto

EC 1.12.99.6 idrogenasi (accettore) (idrogeno:accettore ossidoreduttasi)

H₂ + A = AH₂

EC 1.12.5.1 idrogeno:chinone ossidoreduttasi

H₂ + menachinone = menachinolo

EC 1.12.98.2 5,10-meteniltetraidrometanopterina idrogenasi (idrogeno:5,10-meteniltetraidrometanopterina ossidoreduttasi)

H₂ + 5,10-meteniltetraidrometanopterina = H⁺ + 5,10-metilentetraidrometanopterina

EC 1.12.98.3 metanosarcina-fenazina idrogenasi [idrogeno:2-(2,3-diidropentaprenilossi)fenazina ossidoreduttasi]

H₂ + 2-(2,3-diidropentaprenil)fenazina = 2-diidropentaprenilossifenazina

Note

1. Vignais, P.M., Billoud, B., Meyer, J., Classification and phylogeny of hydrogenases, in FEMS Microbiol. Rev., vol. 25, n. 4, 2001, pp. 455–501, PMID 11524134.
2. Shima, S., Pilak, O., Vogt, S., Schick, M., Stagni, M.S., Meyer-Klaucke, W., Warkentin, E., Thauer, R.K., Ermler, U., The crystal structure of [Fe]-hydrogenase reveals the geometry of the active site, in Science, vol. 321, n. 5888, 2008, pp. 572–575, DOI:10.1126/science.1158978, PMID 18653896.
3. Fontecilla-Camps, J.C., Volbeda, A., Cavazza, C., Nicolet Y., Structure/function relationships of [NiFe]- and [FeFe]-hydrogenases, in Chem Rev, vol. 107, n. 10, 2007, pp. 4273–4303, DOI:10.1021/cr050195z, PMID 17850165.
4. Liebgott PP, Leroux F, Burlat B, Dementin S, Baffert C, Lautier T, Fourmond V, Ceccaldi P, Cavazza C, Meynial-Salles I, Soucaille P, Fontecilla-Camps JC, Guigliarelli B, Bertrand P, Rousset M, Léger C., Relating diffusion along the substrate tunnel and oxygen sensitivity in hydrogenase, in Nat. Chem. Biol., vol. 6, n. 1, 2010, pp. 63–70, DOI:10.1038/nchembio.276, PMID 19966788.
5. Burgdorf, T., Buhrke, T., van der Linden, E., Jones, A., Albracht, S. and Friedrich, B., [NiFe]-Hydrogenases of Ralstonia eutropha H16: Modular Enzymes for Oxygen-Tolerant Biological Hydrogen Oxidation, in J. Mol. Microbiol. Biotechnol., vol. 10, 2005, pp. 181–196, DOI:10.1159/000091564, PMID 16645314.
6. Nicolet, Y., Lemon, B.J., Fontecilla-Camps, J.C. and Peters, J.W., A novel FeS cluster in Fe-only hydrogenases, in Trends Biochem. Sci., vol. 25, n. 3, 2000, pp. 138–143, DOI:10.1016/S0968-0004(99)01536-4, PMID 10694885.
7. Madden, C., Vaughn, M.D., Díez-Pérez, I., Brown, K.A., King, P.W., Gust, D., Moore, A.L., Moore, T.A., Catalytic Turnover of [FeFe]-Hydrogenase Based on Single-Molecule Imaging, in J. Am. Chem. Soc., vol. 134, 2012, pp. 1577–1582, DOI:10.1021/ja207461t, PMID 21916466.
8. Smith, P.R, Bingham, A.S., Swartz, J.R., Generation of hydrogen from NADPH using an [FeFe] hydrogenase, in Int. J. Hydrogen Energy, vol. 37, 2012, pp. 2977–2983, DOI:10.1016/j.ijhydene.2011.03.172.
9. Shima, S., Pilak, O., Vogt, S., Schick, M., Stagni, M.S., Meyer-Klaucke, W., Warkentin, E., Thauer, R.K., Ermler, U., The crystal structure of [Fe]-hydrogenase reveals the geometry of the active site, in Science, vol. 321, n. 5888, 2008, pp. 572–575, DOI:10.1126/science.1158978, PMID 18653896.
10. Salomone-Stagnia, M., Stellatob, F., Whaleyc, C.M., Vogtd, S., Moranteb, S., Shimad, S., Rauchfussc, T.B., Meyer-Klaucke, W., The iron-site structure of [Fe]-hydrogenase and model systems: an X-ray absorption near edge spectroscopy study, in Dalton Transactions, vol. 39, 2010, pp. 3057–3064, DOI:10.1039/b922557a, PMID 20221540.
11. Hiromoto, T., Warkentin, E., Moll, J., Ermler, U., Shima, S., Iron-Chromophore Circular Dichroism of [Fe]-Hydrogenase: The Conformational Change Required for H2 Activation, in Angew. Chem. Int., vol. 48, 2009, pp. 6457–6460, DOI:10.1002/ange.201006255, PMID 21105038.
12. Cornish, A.J., Gärtner, K., Yang, H., Peters, J.W., Hegg, E.L., Mechanism of Proton Transfer in [FeFe]-Hydrogenase from Clostridium Pasteurianum, in J. Biol. Chem., vol. 286, 2011, pp. 38341–38347, DOI:10.1074/jbc.M111.254664, PMID 21900241.
13. Lill, S.O.N., Siegbahn, P.E.M., An Autocatalytic Mechanism for NiFe-Hydrogenase: Reduction to Ni(I) Followed by Oxidative Addition, in Biochemistry, vol. 48, 2009, pp. 1056–1066, DOI:10.1021/bi801218n, PMID 19138102.
14. Cao, Z., Hall, M.B., Modeling the Active Sites in Metalloenzymes. 3. Density Functional Calculations on Models for [Fe]-Hydrogenase: Structures and Vibrational Frequencies of the Observed Redox Forms and the Reaction Mechanism at the Diiron Active Center, in J. Am. Chem. Soc., vol. 123, 2001, pp. 3734–3742, DOI:10.1021/ja000116v, PMID 11457105.
15. Tard, C., Liu, X., Ibrahim, S.K., Bruschi, M., Gioia, L.D., Davies, S.C., Yang, X., Wang, L.S., Sawers, G., Pickett, C.J., Synthesis of the H-cluster framework of iron-only hydrogenase, in Nature, vol. 433, 2005, pp. 610–613, DOI:10.1038/nature03298, PMID 15703741.
16. Vignais, P.M., Billoud, B., Occurrence, Classification, and Biological Function of Hydrogenases: An Overview, in Chem. Rev., vol. 107, 2007, pp. 4206–4272, DOI:10.1021/cr050196r, PMID 17927159.
17. Adams, M.W.W. and Stiefel, E.I., Biological hydrogen production: Not so elementary, in Science, vol. 282, n. 5395, 1998, pp. 1842–1843, DOI:10.1126/science.282.5395.1842, PMID 9874636.
18. Frey, M., <153::AID-CBIC153>3.0.CO;2-B Hydrogenases: hydrogen-activating enzymes, in ChemBioChem, vol. 3, n. 2-3, 2002, pp. 153–160, DOI:10.1002/1439-7633(20020301)3:2/3<153::AID-CBIC153>3.0.CO;2-B, PMID 11921392.
19. Thauer, R. K., Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson (PDF) ^{[collegamento interrotto]}, in Microbiology, vol. 144, 1998, pp. 2377-2406. URL consultato il 4 novembre 2013.
20. Florin, L., Tsokoglou, A. and Happe, T., A novel type of iron hydrogenase in the green algaScenedesmus obliquus is linked to the photosynthetic electron transport chain, in J. Biol. Chem., vol. 276, n. 9, 2001, pp. 6125–6132, DOI:10.1074/jbc.M008470200, PMID 11096090.
21. Hinnemann, B., Moses, P.G., Bonde, J., Jørgensen, K.P., Nielsen, J.H., Horch, S., Chorkendorff, I., Nørskov, J.K., Biomimetic hydrogen evolution: MoS2 nanoparticles as catalyst for hydrogen evolution, in J. Am. Chem. Soc., vol. 127, 2005, pp. 5308–5309, DOI:10.1021/ja0504690, PMID 15826154.
22. Goris, T., Wait, A.F., Saggu, M., Fritsch, J., Heidary, N., Stein, M., Zebger, I., Lendzian, F., Armstrong, F.A., Friedrich, B., Lenz, O., A unique iron-sulfur cluster is crucial for oxygen tolerance of a [NiFe]-hydrogenase, in Nat. Chem. Biol., vol. 7, 2011, pp. 310–318, DOI:10.1038/nchembio.555, PMID 21390036.
23. Liebgott, P.P., Leroux, F., Burlat, B., Dementin, S., Baffert, C., Lautier, T., Fourmond, V., Ceccaldi, P., Cavazza, C., Meynial-Salles, I., Soucaille, P., Fontecilla-Camps, J.C., Guigliarelli, B., Bertrand, P., Rousset, M., Léger, C., Relating diffusion along the substrate tunnel and oxygen sensitivity in hydrogenase, in Nat. Chem. Biol., vol. 6, 2010, pp. 63–70, DOI:10.1038/nchembio.276, PMID 19966788.
24. Stripp, S.T., Goldet, G., Brandmayr, C., Sanganas, O., Vincent, K.A., Haumann, M., Armstrong, F.A., Happe, T., How oxygen attacks [FeFe] hydrogenases from photosynthetic organisms, in Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 106, 2009, pp. 17331–17336, DOI:10.1073/pnas.0905343106, PMID 19805068.
25. Cohen, J., Kim, K., King, P., Seibert, M., Schulten, K., Finding gas diffusion pathways in proteins: application to O2 and H2 transport in CpI [FeFe]-hydrogenase and the role of packing defects, in Structure, vol. 13, 2005, pp. 1321–1329, DOI:10.1016/j.str.2005.05.013, PMID 16154089.

Portale Biologia

Portale Chimica