Il Motivo adiacente al Protospacer (Protospacer adjacent motif, in sigla PAM) è una sequenza di 2-6 paia di basi immediatamente successiva alla sequenza di DNA identificata dalla nucleasi Cas9 nel sistema immunitario adattativo dei batteri mediato dal sistema CRISPR.[1]
PAM è il componente genico del plasmide o virus invadente, ma non è un componente del locus CRISPR del batterio. Se non seguita da nessuna sequenza PAM infatti, la sequenza di DNA da clivare/modificare non sarà né legata né riconosciuta da Cas9.[2][3][4][5]
PAM è un bersaglio essenziale che permette di distinguere il DNA-self dei batteri quello non-self. È infatti assente nei genomi batterici e ciò previene che la nucleasi Cas riconosca e distrugga il locus CRISPR.[6]
I loci CRISPR di un batterio contengono degli "spacers", ovvero dei DNA virali inseriti in un locus CRISPR durante un'infezione pregressa. Nei sistemi immunitari adattativi CRISPR essi sono stati creati a partire dal protospacer, ovvero da DNA del virus o del plasmide invadente.
Pertanto il protospacer è riconosciuto come non-self, mentre lo spacer è riconosciuto come self grazie all'assenza delle PAM.
In seguito ad un'invasione, la nucleasi Cas9 si lega al tracrRNA:crRNA che a sua volta guida la proteina verso la sequenza protospacer del non-self virale.
Ma Cas9 non taglierà la sequenza protospacer a meno della presenza di una sequenza PAM ad essa adiacente.
Gli spacer nei loci CRISPR dei batteri non contengono alcuna sequenza PAM e pertanto non verranno processati dalla nucleasi.
Al contrario, i protospacer dei virus/plasmidi conterranno la sequenza PAM e quindi verranno clivati dalla nucleasi Cas9.
Per l'editing genetico come sostituto del complesso trascrRNA:crRNA si sintetizzano dei gRNAs (guideRNA, RNA Guida) che assolvono alla funzione di riconoscimento delle sequenze geniche precedenti una sequenza PAM all'estremità 3'.[7][8]
La PAM canonica è la sequenza 5'-NGG-3' dove "N" è qualsiasi nucleobase seguita da due nucleobasi contenenti guanina("G").[9]
Gli RNA-Guida (gRNAs) possono trasportare ovunque Cas9 per editare il genoma, a patto che la sequenza da clivare sia vicina ad una PAM.
La PAM canonica è associata alla nucleasi Cas9 dello Streptococcus pyogenes (designato col termine SpCas9); altre PAMs sono associate ad altre proteine Cas9 dei batteri: Neisseria meningitidis, Treponema denticola, e Streptococcus thermophilus.[10]
La sequenza 5'-NGA-3' può essere un'efficientissima PAM non canonica per le cellule umane, anche se la sua efficienza varia in base alla locazione all'interno del genoma.[11] Sono stati effettuati esperimenti per ingegnerizzare una Cas9 in grado di riconoscere diverse PAMs: questo per aumentare le potenzialità del sistema CRISPR-Cas9 permettendogli di editare geni in qualsiasi posizione all'interno del genoma.[12]
Cas9 di Francisella novicida riconosce la sequenza canonica PAM 5'-NGG-3', ma è stata ingegnerizzata per riconoscere anche la PAM 5'-YG-3' (dove "Y" è una pirimidina[13]), pertanto ampliando lo spettro di riconoscimento dei bersagli di Cas9.La nucleasi Cpf1 di Francisella novicida riconosce la PAM 5'-TTTN-3'[14] o la PAM 5'-YTN-3'.[15]
Oltre al sistema CRISPR-Cas9 e CRISPR-Cpf1 vi sono senza dubbio altre nucleasi e PAMs ancora da scoprire.[16]
Ad esempio il sistema CRISPR/C2c2 del batterio Leptotrichia shahii è CRISPR guidato da RNA che etichetta altro RNA piuttosto che DNA. Le PAM non sono fondamentali per un CRISPR che riconosce RNA; tuttavia l'efficacia del suo clivaggio è modulata da un omologo funzionale: una guanina che costeggia la sequenza da clivare, denominata in questo caso PFS (Protospacer Flanking Site).[17]
Una tecnologia denominata GUIDE-Seq è stata escogitata per testare i clivaggi off-target prodotti dalla tecnica CRISPR-Cas9.[18] La necessità di avere una PAM può essere utile per etichettare mutazioni eterozigoti a singolo nucleotide senza provocare alcun effetto aberrante sugli alleli wild-type.[19]
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