EcoRV

EcoRV (lido "eco erre cinco"), tamén chamado Eco32I, é un encima da clase das endonucleases de restrición de tipo II que foi illada de certas cepas da bacteria Escherichia coli. Corta o ADN cando atopa unha determinada secuencia de nucleótidos que recoñece.

Secuencia de recoñecemento no ADN do encima EcoRV. O encima corta en todos os puntos onde apareza esta secuencia. O punto de corte está sinalado cunha liña verde.

O encima EcoRV clivando o ADN. A proteína únese pouco firmemente ao ADN e escanéao buscando a súa secuencia de recoñecemento. Unha vez que a encontra, EcoRV retorce o ADN nun ángulo de 50° e corta a secuencia.

EcoRV
Estrutura cristalina de EcoRV formando un complexo cun ADN bicatenario.
Identificadores
Símbolo	Endonuc-EcoRV
Pfam	PF09233
InterPro	IPR015314
SCOPe	1sx5 / SUPFAM
Estruturas proteicas dispoñibles: Pfam   estruturas / ECOD   PDB RCSB PDB; PDBe; PDBj PDBsum resumo de estruturas

Este encima de restrición ten un uso frecuente en bioloxía molecular. Ten a característica que crea no ADN cortado extremos romos (outros encimas de restrición crean extremos cohesivos). O encima recoñece a secuencia de ADN palindrómica de 6 bases 5'-GAT|ATC-3' e fai un corte vertical nela. A secuencia complementaria é, pois, 3'-CTA|TAG-5'. Os extremos romos poden ser ligados a un sitio de clonación tamén romo doadamente, aínda que con menor eficiencia que os extremos cohesivos.

Estrutura

Resolveuse por cristalografía de raios X a estrutura deste encima, e a de varios mutantes, en complexo co ADN ao que corta.

A parte central (core) do encima consta dunha folla β mixta de cinco cadeas flanqueada por hélices α. Esta parte central está conservada en todos os demais encimas de restrición de tipo II. Tamén ten un subdominio de dimerización N-terminal formado por unha curta hélice α, unha folla de dúas cadeas antiparalelas, e unha longa hélice α. Este subdominio atópase só nos encimas EcoRV e PvuII.^[1]

Modo de acción

Igual que EcoRI, EcoRV forma un homodímero en solución antes de unirse e actuar sobre a súa secuencia de recoñecemento.^[2] Inicialmente, o encima únese feblemente a un sitio non específico do ADN. Desprázase aleatoriamente ao longo da molécula de ADN ata que atopa o seu sitio de recoñecemento.^[1] EcoRV ten unha alta especificidade pola súa secuencia diana no ADN.^[3]

A unión do encima induce un cambio conformacional no ADN, que se curva uns 50°. A curvatura do ADN dá lugar a que as bases non queden ben situadas unhas enriba das outras, amplía o suco menor, e comprime o suco maior. Isto fai que o enlace fosfodiéster que vai ser cortado polo encima quede máis próximo ao centro activo do encima. A clivaxe ou corte ocorre dentro da secuencia de recoñecemento, e non require a hidrólise de ATP.^[1][3]

EcoRV é a única endonuiclease de restrición de tipo II que se coñece que causa un cambio conformacional importante no ADN.^[1]

Usos

EcoRV utilízase frecuentemente para cortar e abrir plásmidos que se van usar como vectores para inserir xenes durante a clonación de xenes. O encima subminístrano moitos fabricantes e require seroalbumina bovina para funcionar axeitadamente.