Johannes von Matuschka ist in London, New York, Paris und Berlin aufgewachsen. Parallel zu seinem Jura-Studium an der Université de Grenoble und an der Humboldt-Universität zu Berlin war er als Schauspieler tätig, unter anderem an der Schaubühne am Lehniner Platz und am Theater am Halleschen Ufer.
Nach dem ersten juristischen Staatsexamen im Jahre 2000 absolvierte er ein Regie- und Schauspielstudium am Wiener Max Reinhardt Seminar.
Von 2004 bis 2006 arbeitete er als Regieassistent an den Münchener Kammerspielen unter anderen mit den Regisseuren Thomas Ostermeier, Johan Simons, Luk Perceval, Stephan Kimmig und Sebastian Nübling.
2007 bis 2008 war er auf Einladung des Goethe-Instituts für das Theaterprojekt Electronic City in Indien. Das Theaterstück von Falk Richter feierte seine Premiere auf dem Hindu Metro Plus Theatre Fest in Chennai, Tamil Nadu. Nach weiteren Arbeiten im Ausland bis 2009 war Matuschka an der Metropolitan Opera in New York und an der Scala in Mailand als Regiemitarbeiter beschäftigt und inszenierte Penthesilée – A bout de souffle am Nationaltheater in Bordeaux- arbeitete er vermehrt an deutschsprachigen Theaterbühnen sowie auf diversen Festivals (u.a. F.I.N.D. Festival Berlin; Kleist Festtage, Frankfurt (Oder)). 2016 machte er an der Staatsoper Hannover sein Operndebüt mit "Der Traumgörge" von Alexander Zemlinsky. Seither realisiert er Arbeiten im Musik- und Sprechtheater.
1998: „Der Prinz von Homburg“, Regie Stephan Lohse, Theater Hallesches Ufer Berlin
2001–2004: „Penthesilea“, „Goldene Zeiten“, „Der Kaukasische Kreidekreis“, Regie Johannes Gleim, Roman Kummer, Ole Georg Graf, Max Reinhardt Seminar Wien
2010: Hauptpreis der Jury der Bayerischen Theatertage für seine Inszenierung Die Große Depression von Arthur Miller
2013: Ensemblepreis der Bayerischen Theatertage für die deutsche Erstaufführung von Besser Wissen – The Knowledge für sein Ensemble vom Staatstheater Nürnberg