Cas12b (von engl. CRISPR-associated, synonym C2c1) ist ein Enzym aus der Gruppe der Endonukleasen und ein Ribonukleoprotein. Es kommt unter anderem in Alicyclobacillus acidoterrestris und Bacillus hisashii vor. Es wird bei der CRISPR/Cas-Methode verwendet, genauer: bei der CRISPR/Cas12b-Methode.
| Alicyclobacillus acidoterrestris CRISPR-associated endonuclease Cas12b | ||
|---|---|---|
| Andere Namen |
AacC2c1, AacCas12b | |
| Masse/Länge Primärstruktur | 1.129 Aminosäuren, 130.611 Da | |
| Bezeichner | ||
| Externe IDs | ||
| Enzymklassifikation | ||
| EC, Kategorie | 3.1.-.- | |
Eigenschaften
Cas12b ist ein Cas-Protein der Klasse II Typ V-B und kommt in Bakterien als Teil der adaptiven antiviralen Immunantwort mit CRISPR vor.[1] Es bindet RNA mit einer crRNA repeat-Sequenz, die wiederum eine tracrRNA bindet. Auf die crRNA repeat-Sequenz folgt eine crRNA spacer-Sequenz, die per Basenpaarung an virale DNA bindet. Daraufhin wird in der viralen DNA durch die Endonukleasefunktion ein Doppelstrangbruch erzeugt. Bei einer Verwendung von Cas12b im Rahmen der CRISPR/Cas-Methode wird die crRNA spacer-Sequenz geändert, um an eine Ziel-DNA zu binden. In der Ziel-DNA muss ein Protospacer Adjacent Motif (PAM) der Sequenz TTN (Thymidin-Thymidin-beliebiges Nukleotid) vorkommen.[1] Der Schnitt der Ziel-DNA erzeugt einen sticky end mit einem 5'-Überhang von 6–8 Nukleotiden 14–17 Nukleotide strangabwärts vom PAM auf dem non-target-Strang bzw. 23–24 Nukleotide strangabwärts vom PAM auf dem target-Strang.[1] Cas12b schneidet DNA bei einer Temperatur zwischen 37 und 60 °C,[1] das Temperatur-Optimum liegt bei 48 °C.[2] Im Vergleich zu Cas9 oder Cpf1 (synonym Cas12a) erzeugt Cas12b weniger unspezifische Schnitte.[3]
Cas12b aus Bacillus hisashii, abgekürzt BhCas12b, ist mit 1108 Aminosäuren kleiner als SpCas9 (1368 Aminosäuren) und hat daher auch ein kleineres Gen, was die Verwendung in viralen Vektoren (insbesondere AAV-Vektoren) erleichtert.[4] Allerdings erzeugt der Wildtyp von BhCas12b bei 37 °C nur Einzelstrangbrüche.[4] Daher wurde eine Mutante von BhCas12b namens BhCas12b v4 entwickelt (K846R/S893R/E837G), die auch bei der Körpertemperatur von Säugetieren Doppelstrangbrüche und weniger unspezifische Schnitte erzeugt.[4]
Literatur
- I. Jain, L. Minakhin, V. Mekler, V. Sitnik, N. Rubanova, K. Severinov, E. Semenova: Defining the seed sequence of the Cas12b CRISPR-Cas effector complex. In: RNA biology. [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] August 2018, doi:10.1080/15476286.2018.1495492, PMID 30022698.
Einzelnachweise
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