Bisulfit-Sequenzierung
biochemische Methode Aus Wikipedia, der freien Enzyklopädie
Die Bisulfit-Sequenzierung ist eine biochemische Methode zur Bestimmung von DNA-Methylierungen im Rahmen epigenetischer Untersuchungen durch Reaktion mit Bisulfit.[1][2] Die Bisulfit-Sequenzierung besteht aus einer Bisulfit-Konversion meistens in Kombination mit einer DNA-Sequenzierung.
Prinzip
Zusammenfassung
Kontext
DNA-Methylierungen kommen in der Epigenetik zur Inaktivierung von Genen vor. Bei Tieren betrifft die Methylierung vor allem Cytosine an der C5-Position in CpG-Dinukleotiden. Durch Behandlung von DNA mit Bisulfit werden durch die Bisulfit-Reaktion unmethylierte Cytosine zu Uracilen konvertiert, während 5-Methylcytosin nicht mit Bisulfit reagiert. Eine anschließende Amplifikation erfolgt meistens per Polymerase-Kettenreaktion (PCR), per methylation-specific PCR (MSP) oder per Microarray.[3][4][5][6] Probleme bei der Bisulfit-Sequenzierung sind die fehlende Unterscheidbarkeit zwischen Methylcytosin und dem in manchen Geweben auftretenden Hydroxymethylcytosin sowie eine unvollständige Bisulfitreaktion bei doppelsträngiger DNA und ein verstärkter Abbau von DNA durch Depurinierung.[7][8][9] Uracil wird in der PCR und DNA-Sequenzierung wie Thymin erkannt und der Gegenstrang aufgrund der Basenpaarung mit Adenin komplementär aufgefüllt, während in der Bisulfit-unbehandelten DNA-Sequenzierung Cytidine mit Guaninen gepaart werden. Daraus ergeben sich zwei DNA-Sequenzen (behandelt und unbehandelt), von denen die Bisulfit-Behandelte an den unmethylierten Stellen C->U-Transitionen aufweist und bei der in einer DNA-Sequenzierung dann mit A anstelle von G gepaart wird. Durch eine vorangehende Oxidation von Hydroxymethylcytosinen können Cytosine eindeutig bestimmt werden.[10]
PCR-basierte Analyseverfahren sind z. B. die DNA-Sequenzierung,[11][12] die Methylation-sensitive single-strand conformation analysis (MS-SSCA),[13] die High resolution melting analysis (HRM),[14] die Methylation-sensitive single-nucleotide primer extension (MS-SnuPE)[15][16] und die Base-specific cleavage/MALDI-TOF.[17][18]
Methylation-specific PCR-Varianten sind z. B. die MSP,[19] die methylierungssensitive qPCR MethyLight,[20][21] die melting curve analysis (Mc-MSP)[22][23] und Oligonukleotid-Microarrays.[24]
Alternative Methoden sind z. B. die Combined Bisulphite Restriction Analysis und die methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP).
Weblinks
Einzelnachweise
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