DNK-ligaza
From Wikipedia, the free encyclopedia
DNK-ligaza je specifičan tip enzima, ligaza, (Šablon:EnzExplorer) koji olakšava spajanje DNK lanaca zajedno, katalizujući formiranje fosfodiesterskih veza. Ima ulogu u popravljanju jednolančanih lomova u dupleksu DNK u živim organizmima, ali neki oblici (kao što je DNK ligaza IV) mogu specifično popraviti dvolančane prekide (tj. prekid u oba komplementarna lanca DNK). Jednolančani prekidi se popravljaju pomoću DNK-ligaze koristeći komplementarni lanac dvostruke spirale kao šablon,[1] sa DNK-ligazom koja stvara konačnu fosfodiestarsku vezu za potpunu popravku DNK.
DNK-ligaza se koristi i u popravak DNK i replikaciju DNK (pogledajte Ligaze sisara). Pored toga, DNK ligaza ima široku upotrebu u laboratorijama molekulske biologije za eksperimente rekombinantne DNK (pogledajte . Prečišćena DNK ligaza koristi se u kloniranju gena za spajanje molekula DNK kako bi se formirala rekombinantna DNK.
Enzimski mehanizam
Mehanizam DNK ligaze je formiranje dvije kovalentne fosfodiesterske veze između 3' hidroksilnih krajeva jednog nukleotida ("akceptora"), sa 5' fosfatnog kraja drugog ("donator"). Za svaku formiranu fosfodiestersku vezu troše se dvije molekule ATP. AMP je potreban za ligaznu reakciju, koja se odvija u četiri koraka:
- Reorganizacija mjesta aktivnosti kao što su urezi u DNK segmentima ili Okazaki fragmentima itd.
- Adenililacija (dodatak AMP) lizinskog ostatka u aktivnom centru enzima, a oslobađa se pirofosfat;
- Prijenos AMP-a na 5' fosfat tzv. donora, stvaranje pirofosfatne veze;
- Formiranje fosfodiestarske veze između 5' fosfata donora i 3' hidroksilnog akceptora.[2]
Ligaza će takođe djelovati sa tupim krajem, iako su potrebne veće koncentracije enzima i različiti uslovi reakcije.
Tipovi
E. coli
Kod E. coli DNK ligazu kodira lig gen. DNK ligaza u E. coli, kao i većina prokariota, koristi energiju dobijenu cijepanjem nikotinamid adenin-dinukleotida (NAD) za stvaranje fosfodiesterske veze.[3] Ne vezuje DNK sa tupim krajevima osim u uslovima molekulske gužve sa polietilen-glikolom i ne može efikasno spojiti RNK sa DNK.
Aktivnost DNK ligaze E. coli može se poboljšati pomoću DNK-polimeraza u pravim koncentracijama. Poboljšanje djeluje samo kada su koncentracije DNK-polimeraze 1 mnogo niže od DNK fragmenata koji se povezuju. Kada su koncentracije Pol I DNK polimeraze veće, to ima negativan učinak na DNK ligazu E. coli[4]
T4
DNK ligaza iz bakteriofaga T4 (bakteriofaga koji inficira bakterije Escherichia coli). T4 ligaza se najčešće koristi u laboratorijskim istraživanjima.[5] Može da ligira ili kohezivni ili tupi kraj DNK, oligonukleotida, kao i RNK RNK–DNK hibrida, ali ne i jednolančane nukleinske kiseline. Također može da ligira DNK sa tupim krajevima sa mnogo većom efikasnošću od DNK ligaza E. coli. Za razliku od DNK ligaza E. coli, DNK ligaza T4 ne može iskoristiti NAD i ima apsolutnu potrebu za ATP kao kofaktorom. Neko inženjerstvo je urađeno da bi se poboljšala in vitro aktivnost T4 DNK ligaze; jedan uspješan pristup, naprimjer, testirao je T4 DNK ligazu spojenu na nekoliko alternativnih proteina koji vežu DNK i otkrio da su konstrukti s p50 ili NF-kB kao fuzijskim partnerima bili preko 160% aktivniji u vezivanju tupih krajeva za kloniranje namjene od divljeg tipa DNK ligaze T4.[6] Tipska reakcija za insertiranje fragmenta u plazmidni vektor koristila bi oko 0,01 (ljepljivi krajevi) do 1 (tupi krajevi) jedinica ligaze. Optimalna temperatura inkubacije za DNK ligazu T4 je 16 °C.
Ligazni mutant bakteriofaga T4 ima povećanu osjetljivost na oba UV zračenja [7][8] i alkilirajući agens metil-metansulfonat[9] što ukazuje da se DNK ligaza koristi u popravkama oštećenja DNK uzrokovanih ovim agensima.
Sisarska
Kod sisara postoje četiri specifična tipa ligaze.
- DNK ligaza I: ligira nastajuću DNK zaostajućeg lanca nakon što je ribonukleaza H uklonila RNK prajmer iz Okazakijevih fragmenata.
- DNK ligaza III: kompleksi sa proteinom popravka DNK XRCC1 za pomoć u zatvaranju DNK tokom procesa popravka ekscizije nukleotida i rekombinantnih fragmenata. Od svih poznatih DNK ligaza sisara, otkriveno je da je samo Lig III, prisutna u mitohondrijama.
- DNK ligaza IV: kompleksi sa XRCC4. On katalizira posljednji korak u spajanju nehomolognog kraja, putu popravke dvolančanog prekida DNK. Takođe je potreban za V(D)J rekombinaciju, proces koji generira raznolikost u imunoglobulinu i lokusima T-ćelijskih receptora tokom razvoja imunskog sistema.
- DNK ligaza II: Artefakt prečišćavanja koji je rezultat proteolitske degradacije DNK ligaze III. U početku je prepoznata kao druga DNK ligaza i to je razlog neobične nomenklature DNK ligaza.[10]
DNK ligaza iz eukariota i nekih mikroba koristi adenozin-trifosfat (ATP) umjesto NAD.[3]
Termostabilnost
Izveden iz termofilne bakterije, enzim je stabilan i aktivan na mnogo višim temperaturama od konvencijskih DNK ligaza. Poluživot mu je 48 sati na 65 °C i više od 1 sat na 95 °C. Pokazalo se da je ampligaza DNK ligaza aktivna za najmanje 500 termičkih ciklusa (94 °C/80 °C) ili 16 sati ciklusa.10 Ova izuzetna termostabilnost omogućava izuzetno visoku hibridizaciju i specifičnost ligacije.[11]
Također pogledajte
- DNK kraj
- Zaostali lanac
- Replikacija DNK
- Okazaki fragment
- DNK-polimeraza
- Sekvenciranje ligacijom
Reference
Vanjski linkovi
Wikiwand - on
Seamless Wikipedia browsing. On steroids.