Endonukleaza

Endonukleaze su enzimi koji cijepaju fosfodiesterske veze u polinukleotidnom lancu. Neki, kao Dezoksiribonukleaza I, sijeku DNK relativno nespecifično (bez obzira na redoslijed), dok su mnogi, obično zvani restrikcijske endonukleaze ili restrikcijski enzimi, režu samo u vrlo specifičnim sekvencama nukleotida.^[1][2]

Restrikcijski enzimi su endonukleaze iz eubakterija i archaea koje prepoznaju određenu DNK. Nukleotidne sekvence koje su prepoznaju restrikcijski enzimi zovu se restrikcijska mjesta. Tipsko restrikcijsko mjesto će biti palindromni niz dug oko 4-6 nukleotida. Većina restrikcijskih endonukleaza siječe DNK neravnomjerno, ostavljajući komplementarne jednolančane krajevime. Ovi ciljevi se mogu ponovo, putem hibridizacije, spojiti, a označavaju se kao ljepljivi krajevi ("sticky ends"). Nakon uparivanja, na fosfodiesterskoj vezi fragmenata može se pridružiti i DNK ligaza.

Postoje stotine poznatih restrikcijskih endonukleaza, od kojih svaka napada različita restrikcijska mjesta. DNK fragmenti rezani od istom endonukleazom, mogu se spojiti, bez obzira na porijeklo DNK. Takva DNK se naziva rekombinantna DNK; sparivanjem gena, DNK se formira u nove kombinacije. Restrikcijske endonukleaze (restrikcijski enzimi) su podijeljeni u tri kategorije, tip I, tip II, i tip III , u skladu sa mehanizam njihovog djelovanja. Ovi enzimi se često koriste u genetičkom inženjerstvu za dobijanje rekombinantne DNK za uvođenje u bakterijske, biljne ili životinjske ćelije, kao i sintetsku biologiju.^[3]

Kategorije

Postoje, dakle, tri kategorije restrikcijskih endonukleaza koje na određeni način doprinose cijepanju pojedinih sekvenci. Tipovi I i III su velike subjedinice većeg kompleksa koji uključuje i endonukleazne i metilazne aktivnosti. Enzimi tipa I mogu sjeći nasumce oko 1000 parova baza ili više od sekvence prepoznavanja i zahtijeva ATP kao izvora energije. Tip II se ponaša malo drugačije i prvi put je izoliran 1970. ([Hamilton Smith). Oni su jednostavnije verzije endonukleaza i ne zahtjevaju ATP u svojim degradacijskim procesima. Neki primjeri restrikcijskih endonukleaza tipa II uključuju BamHI, EcoRI, EcoRV i Haelll. Tip III, međutim, cijepa DNK na oko 25 baznih parova iz sekvence prepoznavanja i u tom procesu zahtijeva potrošnju ATP.^[4][5][6]

Oznake

Restrikcijski enzimom Eco RI

Za oznake restrikcijskih enzima, najčešće se koriste simboli vwxyz, gdje je vwx imenuje oblik života (bakterija), u kojem se mogu naći ovi enzimi y ime soja (i nije obavezan), i z (u rimskim brojevima) ukazuje na različite restrikcijske endonukleaze u istom obliku života (bakterija). Tako, primjerice, "EcoRI" znači da se restrikcijska endonukleaza nalazi u Escherichia coli ("eko"); RI13 ("R"), restrikcijska endonukleaza broj "I". Još jedan primjer: "HaeII" i "HaeIII" odnose se na bakteriju Haemophilus aegyptius, broj II i III, odnosno restrikcijski enzimi koji se koriste u molekulskoj biologiji obično prepoznaju kratke met- sekvence od oko 4-8 baznih parova. Na primjer, EcoRI enzim prepoznaje i cijepa slijed 5 '- GAATTC - 3'.

Restrikcijske endonukleaze se nalaze u nekoliko vrsta. Obično djeluju na određeno mjesto prepoznavanje (obično nukleotidne baze: A, C, G, T). Ako je mjesrto prepoznavanje izvan području cijepanja, onda se restrikcijski enzimnaziva tip I. Kada se slijed prepoznavanje preklapa sekvencom rezanja, zatim takva endonukleaza je restrikcijski enzim tipa II.

Terminologija

Restricijske endonucleaze mogu sjeći lance dsDNK (dvolančanu DNK) ili ssDNK (jednolančanu DNK), ili svaku RNK. Ova rasprava je ograničen na dsDNA, međutim, rasprava se može proširiti na sljedeće:

• Standardna dsDNK
• Nestandardna DNK

1. Hollidayeve veze
2. Trostruka-DNK, četvorostruka-DNK (G-kvadripleks)
3. Dvolančani hibridi DNK i RNK (jedan strand je DNK, drugi je RNK)
4. Sintetska ili umjetna DNK (naprimjer, koja sadrže baze osim A, C, G, T. Istraživanja sa sintetskim kodonima, pogledajte u istraživanjima S. Bennera, a povećanje seta aminokiselina u polipeptidima, štoi tako širi i proteom ili (proteomika), pogledajte istraživanje P. Schultza.

Osim toga, u toku su istraživanja za izgradnju sintetskih i umjetnih restrikcijskih endonukleaza, posebno sa jedinstvenim mjestima prepoznavanja u genomu.

Restrikcijske endonukleaze ili restrikcijski enzimi, tipski sijeku DNK na dva načina, sa:

• tupim krajevima i
• ljepljivim krejevima.

Popravak (reparacija) DNK

Endonukleaze imaju ulogu i u popravku DNK. AP Endonukleaza, konkretno, katalizira rez DNK isključivo na AP lokacijama, a samim tim i pripreme DNK za kasnije ekscizije, sintezu i popravak DNK. Na primjer, kada se dogodi depurinacija, ta lezija ostavlja dezoksiribozni šećer sa nestalom bazom . AP endonukleaza prepoznaje šećer i suštinski smanjuje DNK na ovom mjestu, a onda omogućava nastavak popravke DNK. Ćelije E. coli ćelije sadrže dvije AP endonukleaze: endonukleaza IV (endoIV) i egzonukleaza III (exoIII), dok kod eukariota postoji samo jedna AP endonukleaza.^[7]

Uobičajene endonukleaze

U nastavku su prikazi zajedničkih prokariotskih i eukariotskih endonukleaza.^[8]

Prokariotski enzim	Izvor	Komentari
RecBCD enonucleaza	E. coli	Djelomično ATP ovisna; također egzonukleaznu; funkcije u rekombinacijama i popravkama
T7 Endonukleaza	Fag T7 kodirani (gen 3)	Esencijalna za replikaciju; prednost za jedan zavoj više dvojne DNK
T4 Endonukleaza IV	Faga T4 kodirani (Dena)	Dijeli -TpC- slijed za dobijanje 5'-dCMP-stop oligonukleotida; dužina lanca proizvoda zavisi od uvjeta
Bal 31 Endonukleaza	Alteromonas espejiana	Također egzonukleazna; grickalice udaljeno 3 'i 5' krajevima dupleksa DNK
Endonucleaza I (endo I)	E. coli (Enda)	Periplasmatska lokacija; prosječna dužina lanca proizvoda je 7; inhibirana tRNK; proizvodi dvostruki prekid DNK; proizvodi isječak ukompleksu sa tRNA; endo mutanti normalno rastu
Mikrokokna nukleoza	Staphylococcus	Daje 3'-P terminal; zahtijeva Ca2 +; također djeluje na RNK; preferira jedan DNK i AT-bogate regije
Endonukleaza II (endo VI, Exo III)	E. coli (XTH)	Rascjep pored AP mjesta; Takođe 3 '-> 5' egzonukleaza; fosfomonoesteraza na 3'-P terminalu

Eukariotski enzimi	Izvor	Komentari
Neurosporina endonukleaza	Neurospora crassa	Također djeluje na RNK
S1-nukleoza	Aspergillus oryzae	Također djeluje na RNK
P1-nukleoza	Penicillium citrinum	Također djeluje na RNK
Mungo grah nukleoza I	Mungo klice	Također djeluje na RNK
Ustilago nukleoza (DNase I)	Kvasci	Također djeluje na RNK
DNaza I	Goveđi pankreas	Prosječna dužina lanca proizvoda je 4; proizvodi prekide dvostrukog lanca, u prisustvu Mn2 +
AP Endonukleaza	Nukleus, mitohondrije	U popravak uključena ekscizija i umetanje DNK baza
Endo R	HeLa ćelije	Specifična za GC mjesta

Također pogledajte

• Enzim
• Nukleinske kiseline

Reference

1. Kapur Pojskić L., Ed. (2014): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, 2. izdanje. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 978-9958-9344-8-3.
2. Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.
3. Simon M. (2010): Emergent computation: Emphasizing bioinformatics. Springer, New York, ISBN 1441919635.
4. Kornberg A. (1989): For the love of enzymes – The Odyssay of a biochemist. Harvard University Press, Cambridge (Mass.), London,ISBN 0-674-30775-5, ISBN 0-674-30776-3.
5. Graeme K. Hunter G. K. (2000): Vital Forces. The discovery of the molecular basis of life. Academic Press, London 2000, ISBN 0-12-361811-8.
6. Nelson D. L., Michael M. Cox M. M. (2013): Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freeman, ISBN 978-1-4641-0962-1.
7. Ellenberger T. Et al. (2006): DNA repair and mutagenesis. ASM Press, Washington, D.C, ISBN 1-55581-319-4.
8. Baker T. A., Kornberg A. (2005): DNA replication. University Science, ISBN 1-891389-44-0.

Vanjski linkovi