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同位素分離通過將某種化學元素的其它類型的同位素去除而達到濃縮某種特殊的同位素的目的。例如，通過同位素分離可以將天然鈾分離成濃縮鈾和貧鈾，這是為核電站以及鈾核武器製造鈾燃料的關鍵技術。鈽核武器所使用的鈽在反應爐中製成，同樣需要製備某種特別的同位素。同位素分離的理論由查爾斯·湯斯首先提出。化學元素的提純可以通過化學過程，但是由於相同元素的同位素擁有幾乎完全相同的化學性質，使得化學方法幾乎無法分離同位素，除非是分離氘。
分離同位素的方法主要有三種：
- 利用不同同位素相對原子質量的不同進行物理分離。
- 利用不同同位素相對原子質量的不同造成其在同一化學反應中反應速率的差別進行分離。
- 與同位素相對原子質量無關的方法（如原子核共振）進行分離。此方法仍在實驗階段。
實際中應用的分離技術都在某種程度上利用了同位素相對原子質量上的差異。
就一般情況而言，不同同位素相對原子質量的差異比較大，分離則相對容易。比如，氘的原子核的質量幾乎是氕的兩倍，因此，提純氘要比在天然鈾中分離鈾-235與鈾-238更容易。更極端的例子是將裂變物質鈽-239和雜質鈽-240分離，該項分離難度極大。
大規模的同位素分離方案通常會採用一系列相似的結構，每一級都將前一級的產物繼續濃縮後提供給下一級，使同位素得到多次濃縮、富集。類似的，每一級產生的尾料都交返前一級再處理。這樣形成的同位素提純系統稱為多級結構。
影響多級結構分離同位素性能的因素主要有以下兩點：
到目前為止，大規模的商業化的同位素分離僅僅限於以下三種元素。每一中元素中，兩種最常見的同位素中較為稀少的那個在核技術中有重要的應用，需要被濃縮提純。
其他的一些經過提純的少量同位素會用於特殊的應用中，特別是半導體工業。經過提純的矽會擁有更完美的晶體結構和熱傳導性能[1]。
同位素分離在民用和軍用核技術中都有著重要應用，因此一個國家進行同位素分離的能力是其智庫非常關心的問題。
唯一能夠替代同位素分離的方法是在製備所需要的同位素就將它提純。這可以通過對一個合適的目標進行輻射，但是需要注意選擇合適的目標以及注意其他的一些因素，以使得所需要的同位素是該元素惟一的產物。若生成其他元素的同位素並不是很大的問題，因為我們可以使用化學方法將它們除去。
在製備核武器所使用的高純度鈽-239時就需要注意這個問題。將鈽-239與鈽240或者鈽241分離是非常困難的事情。裂變物質鈽-239通過鈾-238俘獲一個中子而得到，但是再俘獲一個中子將得到非裂變物質鈽-240，更壞的情況是得到鈽-241。因此，生產軍用鈽的鈾只能接受輻射比較短的時間，以儘量減少不需要的同位素。
擴散通常使用氣體，但是也會使用液體。擴散方式的原理是在熱平衡時，兩種具有相同能量的同位素的平均速度會有所不同。較輕的原子（或者包含有該原子的分子）的速度運動的更快，也更容易穿過薄膜。由於速度之比與與質量比的平方根成正比，分離的效率其實並不高，因此為了得到高純度需要很多級來進行分離。由於需要推動氣體穿過薄膜，同時需要非常多的分級擴散裝置，這種方法的成本非常高。
美國在橡樹嶺國家實驗室建成了世界上第一個大型氣體擴散分離工廠，以大規模分離鈾的同位素。該工廠是曼哈頓工程的一部分。工廠中使用了六氟化鈾氣體來進行分離。[2]
氣體離心法利用離心作用通過快速地旋轉物質，使不同核素分離。該過程通常通過使用Z型離心機分離氣體完成。
弗朗西斯·阿斯頓和弗雷德里克·林德曼於1919年提出利用離心機來分離同位素[3]。在1936年，傑西·韋克菲爾德·比姆斯（Jesse Wakefield Beams）和F. B. Haynes使用這種方法成功分離了氯的同位素[4]。然而，在曼哈頓工程中，這種方式因產量太低而未被選用。但是在現代，這種方式成為了分離鈾的同位素的主要方式，氣體離心法也因此成為了一種相對保密的技術，阻礙了各國對這個技術的理解及掌握。
外界氣體離心法的主要了解有：氣體離心法的大致過程為UF6氣體先被送進中心層，隨後送入其他級。[5] 由於達到同樣的濃度氣體離心法需要的級數比較少，消耗的能量也就大幅度下降。實際上，在如今生產濃縮鈾的過程中，氣體離心技術已經替代了氣體擴散技術。
由於達到同樣的濃度需要的能量比較少，工廠的規模也得以大幅減小，使得一些較小的國家也有可能試圖生產核武器。巴基斯坦的核武器中的鈾很可能就是採用這種方式進行生產的。
- 南非在其的赫利孔渦流分離中使用了渦流管來進行同位素分離。氣體被注入一個有特殊幾何形狀的空間後，空間的特殊形狀可以使氣流旋轉得非常快，並使同位素分離。由於渦流管沒有可移動的零件，這種方式非常簡單，但是需要大量的能量。這種方式所需的能量大約是氣體離心法的50倍。
這種方法是一種質譜法，同時這也是該方法的另一個名字。它利用帶電粒子在磁場作用下會發生偏轉，而偏移量於例子的質量有關這個性質將同位素分離。由於這種方法的產量極低，通過該方法分離同位素的成本非常高昂，但是分離的純度相當高。這種方法經常被用來處理很少量純粹的同位素為研究或者其他特殊的應用（如同位素示蹤）使用，但是無法用於大規模的工業化生產。
在橡樹嶺和伯克利加州大學， 歐內斯特·勞倫斯研究了電磁法分離鈾。美國第一顆原子彈使用的大部分鈾都是由這個方法提供的（參見曼哈頓工程）。使用這個原理分離的設備被稱為卡留管。戰後，由於這種方法很不實用而幾乎被捨棄。它僅僅在不計代價的保證需要足夠的核原料的情況下才被採用。它在戰後的主要工作是將氣體擴散工廠生成的核原料進行進一步的濃縮。
在這種方法中，雷射被調整為某一個適當的波長使得核原料中僅僅某一中同位素可以被激發和電離。同位素對光的共振吸收與原子核的質量和某種電子與原子核間超精細作用有關，因此可以通過精確調節雷射的波長使其僅與某種特定的同位素發生作用。原子核電離以後，它可以通過施加一個外加的電場從樣品中移除。這種方式經常被稱為原子蒸汽雷射同位素分離。這種方法在近年來雷射技術改進後才發展起來，但是現在仍然沒有大規模使用。然而，由于于其它方法相比，這種方法可能成本更加低，也更容易被隱藏，這種方法在核擴散領域內引起廣泛關注。這種方法中使用的可調諧雷射包括染料雷射[6]和更新的雷射二極體。
雷射同位素分離的第二種方法被稱為分子雷射同位素分離。這種方法使用紅外雷射來照射六氟化鈾氣體，並將那些包含有鈾-235原子核的分子激發。第二個雷射可以將一個氟原子從被激發的分子中釋放出來，形成五氟化鈾，而這種物質可以從氣體中沉澱出來。由於這種方法的產物五氟化鈾必須重新被氟化成六氟化鈾才能進行下一級提純，這種方法很難以被多極化。這種方法如今正在被改進，以使得僅僅通過一級就可以將鈾-235的濃度提升至95%。這個方法目前仍無法工業化。
最後，由澳大利亞的西勒克斯系統公司開發的第三代雷射鈾濃縮技術SILEX最近被授權給奇異，以建立一個小規模的濃縮工廠。這種方法同樣使用六氟化鈾作為原料，在同位素被電離以後使用磁場將其分離出去。進一步的技術細節沒有被透露。
儘管通常情況下人們認為同種元素的不同同位素擁有相同的化學性質，但嚴格來說這並不成立。其實，原子質量會非常輕微的影響反應速度。
利用化學方法進行分離較輕的原子核將會更加有效，比如分離氫的同位素。輕一些的同位素更容易發生反應，蒸發的也比重同位素快，這樣就可以通過化學方法將他們分離。這也是商業化重水的生產方法，技術細節參見Girdler硫化過程。輕一些的同位素在電場的作用下分離的更快。在德國尤坎的重水生產基地就利用這個性質進行了多級工業化生產。
利用動力學同位素效應對同位素進行分離的備選方案可能最終被用於分離氚。將氚化的甲酸陰離子氧化為氚化水的效應如下：
| k(HCO2-) = 9.54 M−1s−1 | k(H)/k(D) = 38 |
| k(DCO2-) = 9.54 M−1s−1 | k(D)/k(T) = 8.1 |
| k(TCO2-) = 9.54 M−1s−1 | k(H)/k(T) = 305 |
碳、氧和氮的同位素可以通過在很高的分離塔（大約70到200米）中將它們的氣體單質或者氣體化合物冷卻至接近液化溫度從而得到分離。比較重的元素會下沉，而比較輕的元素會上浮，這樣就很容易被收集了。這種方式在1960年代末由洛斯阿拉莫斯國家實驗室的科學家發明[1]（頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）。 這種方式也被稱為低溫蒸餾[2]。
分離功單位是一個複雜的計量單位。它是用於處理的鈾的數量和得到的純度的函數，也就是鈾-235在經過濃縮以後的所增加的比例。如果原料和產物的數量都使用千克進行計算，這個計量單位被用于衡量分離單位質量的同位素所消耗的能量。
例如，如果有100千克天然鈾，那麼需要60SWU易產生10千克的U-235純度為4.5%的鈾。
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