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分子生物学技术 来自维基百科，自由的百科全书
DNA定序（DNA sequencing）又稱DNA測序，是指分析特定DNA片段的鹼基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤（G）的排列方式。快速的DNA定序方法的出現極大地推動了生物學和醫學的研究和發現。
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在基礎生物學研究中，和在眾多的應用領域，如診斷，生物技術，法醫生物學，生物系統學中，DNA序列知識已成為不可缺少的知識。具有現代的DNA定序技術的快速定序速度已經有助於達到定序完整的DNA序列，或多種類型的基因組定序和生命物種，包括人類基因組和其他許多動物，植物和微生物物種的完整DNA序列。
RNA定序則通常將RNA提取後，反轉錄為DNA後使用DNA定序的方法進行定序。目前應用最廣泛的是由弗雷德里克·桑格發明的桑格定序[1]。新的定序方法，例如454生物科學的方法和焦磷酸定序法。
DNA定序可用於確定任何生物的單個基因的序列，較大的遺傳區域（即基因簇或操縱子的簇），完整的染色體或整個基因組。 DNA定序也是對RNA或蛋白質進行定序的最有效方法（通過對開放閱讀框定序）。目前，DNA定序已成為生物學和其他科學領域（如醫學，法醫學或人類學等）的關鍵技術。
在分子生物學中，DNA定序可被用於研究基因組及其編碼的蛋白質。利用定序獲得的資訊，科研人員能夠辨識基因的變化，基因與疾病和表型的關聯，並確定潛在的藥物靶點。
由於DNA是攜帶有遺傳資訊的大分子，在演化生物學中，DNA定序被用於研究不同生物體之間的相關性以及它們是如何演化的。
宏基因組學是一門直接取得環境中所有遺傳物質的研究。環境包括但不限於水體，污水，污垢，從空氣中過濾出的碎片或者從生物體採集的樣本。了解在特定環境中存在哪些生物體對於生態學，流行病學，微生物學和其他領域的研究至關重要。DNA定序使研究人員能夠確定微生物群中可能存在哪些類型的微生物。
醫療人員可通過對患者基因（基因組）的定序結果確定該患者是否有攜帶遺傳性疾病的風險。需要注意的是，該方法屬於基因檢測，有些基因檢測不會用到DNA定序技術。
DNA定序可以與DNA圖譜鑑定（基因指紋分析，英語：DNA profiling）一起用於法醫鑑定和親子鑑定。 DNA測試在過去的幾十年中發展迅猛，目前已能夠做到將DNA鑑定結果與被調查對象聯絡起來。指紋，唾液，毛囊等中的DNA特徵可以將不同的生物體進行區分。測試DNA是一種可以檢測DNA鏈中特定基因組並生成唯一的個性化DNA模型的技術。每一種有機體都有其DNA特徵，並可以通過DNA測試來確定。兩個人具有完全相同的DNA特徵是非常罕見的，因此保證了DNA測試的成功。
去氧核糖核酸（DNA）最早在1869年由Friedrich Miescher發現並分離出來，但由於當時普遍認為遺傳資訊儲存於蛋白質而不是DNA中，因此在過去幾十年中DNA一直沒有得到充分研究。1944年，由於Oswald Avery，Colin MacLeod和Maclyn McCarty的一些實驗表明，純化的DNA可以將一種細菌變成另一種細菌，這種情況才發生了變化。這也是首次DNA顯示出改變細胞特性的能力。
1953年，James Watson和Francis Crick根據Rosalind Franklin研究的結晶X射線結構提出了他們的雙螺旋DNA模型。根據該模型，DNA由彼此纏繞的兩條核苷酸鏈組成，通過氫鍵連接在一起並以相反方向執行。每條鏈由四個互補的核苷酸組成：腺嘌呤（A），胞嘧啶（C），鳥嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），其中A與T配對，C與G配對。他們提出的這種結構，使得每條單鏈都可被用於重建另一條鏈，並且讓遺傳資訊代代相傳。
對蛋白質進行定序的基礎首先由弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）的工作奠定，他於1955年完成了胰島素（胰腺分泌的一種蛋白質）中所有胺基酸序列的定序工作。這是首個確鑿的證據證明蛋白質是具有特定分子模式的化學實體，而不是懸浮在流體中的隨機混合物。桑格在胰島素定序方面的成功使得X射線晶體學家大為振奮，包括華生和克里克，他們現在正試圖理解DNA如何指導細胞內蛋白質的形成。在1954年10月弗雷德里克·桑格出席一系列講座後不久，克里克開始發展一種理論，認為DNA中核苷酸的排列決定了蛋白質中胺基酸的序列，從而幫助確定蛋白質的功能。他於1958年發表了這一理論。
RNA定序是最早的核苷酸定序形式之一。 RNA定序的主要標誌是1972年和1976年Walter Fiers及其同事在根特大學（根特，比利時）確定並發表的第一個完整基因序列和噬菌體MS2的完整基因組。傳統的RNA定序方法需要建立一個用於定序的互補cDNA（complementary DNA）分子。
確定 DNA 序列的第一種方法涉及由康奈爾大學的吳瑞於1970年建立的位置特異性引子延伸策略[2]。 DNA聚合酶催化和特定核苷酸標記，這兩者在當前的定序方案中都很重要，用於對λ噬菌體DNA的粘性末端進行定序[3][4][5]。在1970年至1973年間，吳瑞、R Padmanabhan及其同事證明，該方法可用於使用合成的位置特異性引子確定任何DNA序列[6][7][8]。隨後弗雷德里克·桑格(Frederick Sanger)採用這種引子延伸策略在英國劍橋的英國醫學研究委員會(MRC)中心開發了更快速的DNA定序方法，並於1977年發表了「使用鏈終止抑制劑進行DNA定序」的方法。
第一個完整的DNA基因組定序是在1977年Φ-X174噬菌體（Phage Φ-X174）的定序工作。醫學研究委員會的科學家在1984年破譯了Epstein-Barr病毒的完整DNA序列，發現它含有172,282個核苷酸。 該序列的完成標誌著DNA定序的一個重要轉折點，它在沒有病毒基因譜知識的情況下實現了DNA定序。
20世紀80年代初，Pohl及其同事開發了一種在電泳時將定序反應混合物的DNA分子轉移到固定基質上的非放射性方法。隨後GATC Biotech公司的DNA定序儀「Direct-Blotting-Electrophoresis-System GATC 1500」商業化，該定序儀在EU基因組定序程式的框架以及酵母釀酒酵母染色體II的完整DNA序列中廣泛使用。加利福尼亞理工學院的Leroy E. Hood實驗室於1986年宣布了第一台半自動DNA定序機。隨後，Applied Biosystems在1987年推出了第一台全自動定序儀ABI 370。以及Dupont公司的Genesis 2000，該儀器使用了一種新的螢光標記技術，可在單一泳道中辨識所有四個雙去氧核苷酸。到1990年，美國國立衛生研究院（NIH）已開始對支原體，大腸桿菌，秀麗隱杆線蟲和釀酒酵母進行大規模定序實驗，費用為每個鹼基0.75美元。同時，人類cDNA序列的定序始於Craig Venter的實驗室，試圖取得人類基因組的編碼部分。 1995年，Venter，Hamilton Smith及其基因組研究所（TIGR）的同事發表了第一個完整的自由生物體細菌流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）的基因組。該環形染色體中含有1,830,137個鹼基，其在《科學》雜誌中的發表標誌著全基因組鳥槍法定序的首次公開使用，擺脫了初始繪製工作的需要。
1990年代中後期開發了幾種新的DNA定序方法，並於 2000年在商業DNA定序儀中實施。這些方法統稱為「下一代」或「第二代」定序 (NGS) 方法，以便將它們與包括桑格定序在內的早期方法區分開來。 與第一代定序相比，NGS 技術的典型特徵是高度可延伸，允許一次對整個基因組進行定序。通常，這是通過將基因組片段化成小塊、隨機採樣片段並使用多種技術之一對其進行定序來實現的，例如下面描述的那些。 整個基因組定序是可能的，因為在一個自動化過程中同時對多個片段進行定序（命名為「大規模並行」定序）。
1990年10月26日，錢永健、Pepi Ross、Margaret Fahnestock 和 Allan J Johnston 提交了一項專利，描述了在 DNA 陣列（墨點和單個 DNA 分子）上使用可移除的 3' 阻斷劑進行逐步（「鹼基對鹼基」）定序[10]。 1996 年，斯德哥爾摩皇家理工學院的波爾·尼倫(Pål Nyrén) 和他的學生穆斯塔法·羅納吉(Mostafa Ronaghi)發表了他們的焦磷酸定序方法[11]。
1997年4月1日，Pascal Mayer和Laurent Farinelli 向世界智慧財產權組織提交了描述DNA菌落定序的專利[12]。 本專利中描述的DNA樣品製備和隨機表面聚合酶連鎖反應 (PCR) 陣列方法，與錢永健等人的「鹼基對鹼基」定序方法相結合，現已在Illumina公司的Hi-Seq基因組定序儀中實施。
馬克薩姆-吉爾伯特定序（英語：Maxam-Gilbert sequencing）是一項由阿倫·馬克薩姆與沃爾特·吉爾伯特於1976～1977年間開發的DNA定序方法。此項方法基於：對核鹼基特異性地進行局部化學改性，接下來在改性核苷酸毗鄰的位點處DNA骨架發生斷裂[13] 。
Sanger（桑格）雙去氧鏈終止法是弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）於1975年發明的。定序過程需要先做一個聚合酶連鎖反應（PCR）。PCR過程中，雙去氧核苷酸可能隨機地被加入到正在合成中的DNA片段里。由於雙去氧核糖核苷酸又少了一個氧原子，一旦它被加入到DNA鏈上，這個DNA鏈就不能繼續增加長度。最終的結果是獲得所有可能獲得的、不同長度的DNA片段。目前最普遍最先進的方法，是將雙去氧核糖核苷酸進行不同螢光標記。將PCR反應獲得的總DNA通過毛細管電泳分離，跑到最末端的DNA就可以在雷射的作用下發出螢光。由於ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP（4種雙去氧核糖核苷酸）螢光標記不同，電腦可以自動根據顏色判斷該位置上鹼基究竟是A，T，G，C中的哪一個[14]。
霰彈槍定序法（shotgun sequencing，又稱鳥槍法）是一種廣泛使用的為較長DNA定序的方法。它比傳統的定序法快速，但精確度較差。霰彈槍定序法曾經使用於塞雷拉基因組（Celera Genomics）公司所主持的人類基因組計劃。
![[icon]](#/media/File:Wiki_letter_w_cropped.svg){kind=small} | 此章節尚無任何內容，需要擴充。 (2021年2月3日) |
隨著人們對低成本定序的需求與日俱增，推動了高通量定序（high-throughput sequencing）的發展，此技術又稱為二代定序（second generation sequencing）、新一代定序（next-generation sequencing）、次世代定序、大規模平行定序（massively parallel signature sequencing，MPSS），即邊合成邊定序，一次可以對幾十萬至數億條DNA模板同時進行序列測定。這些技術對定序過程采多路復用，同時產生上千或上百萬條序列[15][16]。高通量定序技術的目的是降低DNA定序的成本，這個成本比同樣可實現定序的染料終止法來得低得多[17]。超高通量定序過程中可同時執行高達500,000次的邊合成邊定序[18][19][20]。
| 方法 | 單分子即時定序（Pacific Bio） | 離子半導體（Ion Torrent sequencing） | 焦磷酸定序（454） | 邊合成邊定序（Illumina） | 邊連接邊定序（SOLiD sequencing） | 鏈終止法（Sanger sequencing） |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 讀長 | 5,500 bp to 8,500 bp avg (10,000 bp N50); maximum read length >30,000 bases[23][24][25] | up to 400 bp | 700 bp | 50 to 300 bp | 50+35 or 50+50 bp | 400 to 900 bp |
| 精確度 | 99.999% consensus accuracy; 87% single-read accuracy[26] | 98% | 99.9% | 98% | 99.9% | 99.9% |
| 每次執行可取得讀段數 | 50,000 per SMRT cell, or ~400 megabases[27][28] | up to 80 million | 1 million | up to 3 billion | 1.2 to 1.4 billion | N/A |
| 每次執行耗時 | 30 minutes to 2 hours [29] | 2 hours | 24 hours | 1 to 10 days, depending upon sequencer and specified read length[30] | 1 to 2 weeks | 20 minutes to 3 hours |
| 每百萬鹼基所耗成本（美元） | $0.33-$1.00 | $1 | $10 | $0.05 to $0.15 | $0.13 | $2400 |
| 優勢 | Longest read length. Fast. Detects 4mC, 5mC, 6mA.[31] | Less expensive equipment. Fast. | Long read size. Fast. | Potential for high sequence yield, depending upon sequencer model and desired application. | Low cost per base. | Long individual reads. Useful for many applications. |
| 劣勢 | Moderate throughput. Equipment can be very expensive. | Homopolymer errors. | Runs are expensive. Homopolymer errors. | Equipment can be very expensive. Requires high concentrations of DNA. | Slower than other methods. Have issue sequencing palindromic sequence.[32] | More expensive and impractical for larger sequencing projects. |
454定序法由454生物科學發明，是一個類似焦磷酸定序法的新方法。2003年向GenBank提交了一個腺病毒全序列[33]，使得他們的技術成為Sanger定序法後第一個被用來測生物基因組全序列的新方法。454使用類似於焦磷酸定序的方法，有著相當高的讀取速度，大約為5小時可以測兩千萬鹼基對[33]。
高通量定序能一次對幾十到幾百萬DNA分子進行序列測定。
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