повтори послідовності ДНК З Вікіпедії, вільної енциклопедії
Короткі паліндромні повтори, регулярно розташовані групами (англ.CRISPR — Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)— це прямі повтори та унікальні послідовності в ДНК бактерій і архей, що розділяють їх, які спільно з асоційованими генами (Cas, англ.CRISPR-associated genes) забезпечують захист клітини від чужорідних генетичних елементів (бактеріофагів, плазмід). CRISPR-касети виявлені в геномах багатьох бактерій і більшості архей[1]. Повтори мають довжину від 24 до 48 пар нуклеотидів; вони мають бівалентну симетрію, але, як правило, не є істинними паліндромами. Повтори розділені варіабельними ділянками ДНК, спейсерами, приблизно однакової довжини. Спейсери відповідають по нуклеотидній послідовності певним фрагментам ДНК чужорідних генетичних елементів (протоспейсерам). У зв'язку з цим було запропоновано і потім показано, що послідовності, що розділяють повтори, походять з послідовностей геномів бактеріофагів і, відповідно, забезпечують захист клітин від інфекцій.
Діаграма, що ілюструє можливий механізм CRISPR.
В результаті досліджень механізму дії CRISPR-системи було зроблено припущення, що вона є прокаріотичним аналогом системи РНК-інтерференціїеукаріот і забезпечує бактеріям і археям захист від бактеріофагів[2].
Патогенні та синантропні бактерії містять велику кількість білка Cas9 (англ.CRISPR-associated 9). Було показано, що система CRISPR/Cas може брати активну участь у регуляції ендогенних бактеріальних генів, зокрема, при взаємодії бактерій з еукаріотичним організмом, в якому вони паразитують. Наприклад, білок Cas9 з Francisella novicida використовує унікальну, CRISPR/Cas-асоційовану малу РНК (scaRNA) для пригнічення ендогенного транскрипту мРНК, що кодує бактеріальний ліпопротеїн, що дозволяє їй послабити імунну відповідь хазяїна й підвищити її вірулентність[3].
Розроблено методи високовибіркового активування[4] й інгібування генів[5], що базуються на системі CRISPR/Cas9 (CRISPR-системі II типу)[6][7][8][9][10][11][12][13]. Основними компонентами CRISPR-системи II типу є CRISPR-касета, на основі якої синтезуються напрямні crPHK (англ.CRISPR RNA), нуклеаза Cas9 (Csn1) і tracrPHK (англ.trans-activating crRNA), необхідна для процесингу напрямної РНК[1][14][15]. Для спрямованого редагування генома еукаріотів використовують Cas9 Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus(інші мови), Neisseria meningitidis[16][17], а також Cas9 з Staphylococcus aureus (SaCas9), яка на 25% менша за розмірами, що дозволяє упаковувати її в аденоасоційований вірус (AAV) для доставки вектора в клітини живого організму, як терапевтичний засіб[18][19][20]. Походження ферменту накладає деякі обмеження на вибір ДНК-мішеней: наприклад при використанні Cas9 S. pyogenes, як мішені можна вибирати тільки послідовності, за якими йде 5'-NGG (де N— будь-який нуклеотид). Перед використанням у генетичних конструкціях ген Cas9 потрібно попередньо оптимізувати за використовуваними кодонама відповідно до організму, геном якого передбачається модифікувати[14].
З метою спрощення маніпуляцій з клонуванням лентивірусних або ретровірусних векторів доставки, crPHK і tracrPHK об'єднують в одну суцільну sgPHK (англ.single guide RNA, sgRNA)— так званий «all-in-one CRISPR-Cas9 cloning vector»[21]. Це дозволяє полегшити конструювання та клонування серії векторів доставки, що відрізняються тільки по пришитій до tracrRNA ланцюжку «гідРНК» (англ.guide RNA), яка впізнає комплементарну їй, послідовність ДНК, вибрану в геномі за замовленням дослідника[22].
Розроблена також технологія самоклонувальних CRISPR/Cas9, що дозволяє взагалі обійтися без клонування, а використовувати коротку дволанцюгову ДНК з послідовністю, що кодує бажаний локус і плазміду, несе саморозщеплювальну паліндромну sgPHK. Це дозволяє скоротити час на підготовки експерименту всього до 2-х годин, а його вартість здешевити в шість разів[23].
Модифікація ДНК-зв'язуючого домену Cas9 і його злиття з різними регуляторними доменами дозволяє отримати вибірково напрямні на потрібні ділянки геному за допомогою РНК-гідів штучні фактори транскрипції (crisprTF) і ефектори[24], штучні ендонуклеази рестрикції[25][26], репрессори, а також ферменти, що модифікують епігеном, такі як ДНК-метилази, деметилази і гістонацетилтрансферази, що дозволяє вибірково регулювати активність певних генів[27]. Крім того знайдені аналоги Cas9, які здатні розщеплювати замість ДНК молекули РНК, що дозволяє редагувати або вибірково пригнічувати активність мікроРНК[28][29]. Так, наприклад, Cas9 з грамнегативної бактерії Francisella novicida (FnCas9) може бути перепрограмований так щоб спрямувати його на РНК геном вірусу гепатиту C, що призводить до інгібування синтезу вірусного білка в клітині[30]. На основі цієї системи можна створити сотні засобів для захисту проти різних вірусів.
Метод сайт-селективного редагування геному за допомогою ферменту, що впізнає необхідну послідовність ланцюга ДНК «за наведенням» комплементарного їй РНК «гіду», обіцяє революційні зміни в дослідженнях та лікуванні цілого ряду захворювань, від раку[31] і невиліковних вірусних хвороб до спадкових генетичних патологій на кшталт серповидноклітинної анемії і синдрому Дауна[32]. Він дозволив здешевити, спростити і прискорити розробку генномодифікованих мікроорганізмів[9], рослин[33][34] і домашньої худоби, а також допоможе в розробленні генної терапії спадкових захворювань у людських ембріонів[35][36]. Так, наприклад, технологія, розроблена Editas, дозволяє взяти клітину з тіла живого організму, замінити певні ділянки ДНК, а потім повернути клітину на колишнє місце. Передбачається, що таким чином можна запустити процес лікування деяких типів захворювань[37].
Прикріпивши до білка Cas9, дефектного по екзонуклеазній активності, зелений флуоресцентний білок EGFP, можна отримати інструмент для візуалізації геномних послідовностей в живих клітинах ссавців і візуального визначення довжини теломер хромосоми, а також відстежувати динаміку генних локусів протягом клітинного циклу[38].
Науковцям з Медичної школи Перельмана Університету Пенсильванії та Дитячої лікарні Філадельфії (CHOP) вдалося під час вагітності лабораторної миші відредагувати ген, аби запобігти летальному порушенню обміну речовин у потомства. Дослідники впевнені, що така технологія допоможе боротися із вродженими захворюваннями людини ще до народження.
В результаті генного редагування миші не лише вижили, а й виявилися значно здоровішими, ніж їхні побратими, які проходили медикаментозне лікування HT1.
Протягом трьох місяців після народження жодних негативних наслідків від втручання в ДНК не зафіксовано.[39]
Вчені у 2019 році, створили перші у світі генно-редаговані ящірки, використовуючи інструмент для редагування генів CRISPR-Cas9.[40]
Питання про можливість редагування людських генеративних (статевих) клітин, з яких формується новий організм, підіймалося багатьма вченими через порівняну простоту використання CRISPR/Cas9 системи. Проте в квітні 2015 року опублікована перша робота у журналі Protein & Cell в якій китайські вчені використали CRISPR/Cas9 систему для редагування генів нежиттєздатних яйцеклітин людини для лікування таласемії[41]. Ооцити були заплідненні двома сперматозоїдами і мали відповідно три пронуклеуси— двоє батьківських та один материнській. Такі ооцити проходять перші стадії ембріонального розвитку, проте потім ембріон далі розвиватися не може і відбувається викидень (спонтанний аборт). Те, що робота над редагуванням геному була проведена над нежиттєздатними ооцитами все одно загострила питання етики і по словам автора статті Джін'ю Хуанга цю роботу відмовилися приймати у найвагоміших наукових рецензованих журналах Nature та Science[41]. В даній роботі науковці використовували CRISPR/Cas9 систему для редагування гену HBB, що кодує β-глобін. Мутації в цьому гені призводять до спадкового аутосомного захворювання бета-таласемії[41].
У вересні 2015 року декілька наукових установ Великої Британії, такі як Wellcome Trust та Рада медичних досліджень Великої Британії[en], опублікували заяву, в якій йдеться про те, що використання CRISPR/Cas9 системи в дослідженнях ембріонів людини є виправданим і потрібним. Незабаром до них приєдналися декілька інших груп[43]. В результаті Лондонське королівське товариство, Китайська академія наук, Національна академія наук США та Національна академія медицини США[en] домовилися провести саміт у грудні 2015 року для вирішення питань редагування генів генеративних клітин (яйцеклітин, сперматозоїдів та зиготи).[43]
3 грудня 2015 року міжнародних саміт з питань редагування генів людини дозволив використання методів генної інженерії лише на тих генеративних клітинах чи ранніх ембріонах людини, які не будуть використані для набуття вагітності. Також на саміті дозволено розвивати методи генної інженерії для лікування генів в соматичних, тобто не спадкових, клітинах (напр. модифікації імунних клітин для боротьби з пухлинами). Проте впродовж 2016 року ця тема повинна бути детальніше обговорена і повинні пройти ще декілька конференцій та дискусій перед остаточним рішенням міжнародної наукової спільноти. Організатори саміту підкреслюють, що вони не називають це «забороною» редагування генеративних клітин людини в дослідницьких цілях, бо це питання ще не остаточно вирішено.[44]
PMID 21552286 (PMID21552286) Бібліографічний опис з'явиться автоматично через деякий час. Ви можете підставити цитату власноруч або використовуючи бота.
Kira S. Makarova, Yuri I. Wolf and Eugene V. Koonin (2013) Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucl. Acids Res. 41(8): 4360-4377. DOI:10.1093/nar/gkt157
Lei S. Qi, Matthew H. Larson, Luke A. Gilbert, Jennifer A. Doudna, Jonathan S. Weissman, Adam P. Arkin, Wendell A. Lim.(2013) Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression. Cell, 152 (5): 1173—1183 DOI:10.1016/j.cell.2013.02.022
Cho, S.W., Kim, S., Kim, J.M., and Kim, J.-S (2013) Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat. Biotechnol. DOI:10.1038/nbt.2507
Hwang, W.Y., Fu, Y., Reyon, D., et al. and Joung, J.K. (2013) Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol., DOI:10.1038/nbt.2501
Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., and Marraffini, L.A. (2013) RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat. Biotechnol., DOI:10.1038/nbt.2508
Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., and Doudna, J. (2013) RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471. http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00471.001
PMID 24157548 (PMID24157548) Бібліографічний опис з'явиться автоматично через деякий час. Ви можете підставити цитату власноруч або використовуючи бота.
Karvelis, T., Gasiunas, G., Miksys, A., Barrangou, R., Horvath, P., & Siksnys, V. (2013). crRNA and tracrRNA guide Cas9-mediated DNA interference in Streptococcus thermophilus. RNA biology, 10(5), 20-19. DOI:10.4161/rna.24203
Hou, Z., Zhang, Y., Propson, N. E.,et al. & Thomson, J. A. (2013). Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. PNAS, 110(39), 15644-15649 DOI:10.1073/pnas.1313587110
Ines Fonfara, Anaïs Le Rhun, Krzysztof Chylinski, Kira Makarova, Anne-Laure Lécrivain, Janek Bzdrenga, Eugene V. Koonin, Emmanuelle Charpentier (2013) Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. DOI:10.1093/nar/gkt1074
Malina, A., Mills, J. R., Cencic, R., et al. & Pelletier, J. (2013). Repurposing CRISPR/Cas9 for in situ functional assays. Genes & development, 27(23), 2602—2614. Genes & Dev. . 27:2602-2614 DOI:10.1101/gad.227132.113
Kearns, N. A., Genga, R. M., Enuameh, M. S.,et al. & Maehr, R. (2014). Cas9 effector-mediated regulation of transcription and differentiation in human pluripotent stem cells. Development, 141(1), 219—223. DOI:10.1242/dev.103341
John P Guilinger, David B Thompson & David R Liu (2014). Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nature Biotechnology, DOI:10.1038/nbt.2909
Mitchell R. O'Connell, Benjamin L. Oakes, Samuel H. Sternberg, Alexandra East-Seletsky, Matias Kaplan, Jennifer A. Doudna. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature, 2014; DOI:10.1038/nature13769
Hale, C. R., Zhao, P., Olson, S.,et al. & Terns, M. P. (2009). RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex. Cell, 139(5), 945—956, DOI:10.1016/j.cell.2009.07.040
Aryn A. Price, Timothy R. Sampson, Hannah K. Ratner, Arash Grakoui, and David S. Weiss. Cas9-mediated targeting of viral RNA in eukaryotic cells. PNAS. DOI:10.1073/pnas.1422340112
Yin, H., Xue, W., Chen, S., Bogorad, R. L., Benedetti, E., Grompe, M., … & Anderson, D. G. (2014). Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology. DOI:10.1038/nbt.2884
Wenzhi Jiang, Huanbin Zhou, Honghao Bi, Michael Fromm, Bing Yang, and Donald P. Weeks (2013) Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucl. Acids Res. (2013) 41 (20): e188 DOI:10.1093/nar/gkt780
Baohui Chen, Luke A. Gilbert, Beth A. Cimini, et al. & Lei S. Qi, Bo Huang (December 2013) Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System. 155(7), 1479—1491. DOI:10.1016/j.cell.2013.12.001
Cressey, Daniel; Abbott, Alison; Ledford, Heidi (2015). UK scientists apply for licence to edit genes in human embryos. Nature. doi:10.1038/nature.2015.18394. ISSN1476-4687.
Sander, J. D.; Joung, J. K. (2014). CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. DOI:10.1038/nbt.2842. PMID24584096.
Terns, R. M.; Terns, M. P. (2014). CRISPR-based technologies: Prokaryotic defense weapons repurposed. Trends in Genetics, 30 (3): 111. DOI:10.1016/j.tig.2014.01.003. PMID24555991.
Edze R. Westra, Angus Buckling & Peter C. Fineran (2014). CRISPR-Cas systems: beyond adaptive immunity. Nature Reviews Microbiology. DOI:10.1038/nrmicro3241
Rodolphe Barrangou (2014). Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution. SCIENCE. 344 (6185): 707—708. doi:10.1126/science.1252964.
Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G (2005). CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151: 653. doi:10.1099/mic.0.27437-0. PMID15758212.
Haft DH, Selengut J, Mongodin EF, Nelson KE (2005). A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes. PLoS Comput Biol. 1 (6): e60. doi:10.1371/journal.pcbi.0010060. PMID16292354.{{cite journal}}: Обслуговування CS1: Сторінки із непозначеним DOI з безкоштовним доступом (посилання)
Makarova KS, Grishin NV, Shabalina SA, Wolf YI, Koonin EV (2006). A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol Direct. 1: 7. doi:10.1186/1745-6150-1-7. PMID16545108.{{cite journal}}: Обслуговування CS1: Сторінки із непозначеним DOI з безкоштовним доступом (посилання)
Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P. (2007). CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819): 1709. doi:10.1126/science.1138140. PMID17379808.
Sorek R, Kunin V, Hugenholtz P (2007). CRISPR - a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea. Nat Rev Microbiol. 6: 181. doi:10.1038/nrmicro1793. PMID18157154.
Andersson AF, Banfield JF (2008). Virus population dynamics and acquired virus resistance in natural microbial communities. Science. 320: 1047. doi:10.1126/science.1157358. PMID18497291.
Brouns SJJ, Jore MM, Lundgren M, Westra ER, Slijkhuis RJH, Snijders APL, Dickman MJ, Makarova KS, Koonin EV, Van der Oost J (2008). Small CRISPR RNAs Guide Antiviral Defense in Prokaryotes. Science. 321: 960. doi:10.1126/science.1159689. PMID18703739.
Heidi Ledford (2015). CRISPR, the disruptor. A powerful gene-editing technology is the biggest game changer to hit biology since PCR. But with its huge potential come pressing concerns. NATURE. 522: 20—24. doi:10.1038/522020a.