Protein çözümleme

Protein çözümleme veya protein assay, bir solüsyondaki çözünmüş formdaki bir proteinin konsantrasyonunu ölçmek için kullanılan analitik spektroskopik bir yöntemdir. Öznel bir yöntemdir, yani örneğin ölçülen bir proteindeki amino asidin bileşimine bağımlıdır. Bu yöntem Marion M. Bradford tarafından bulunduğundan Bradford protein çözümlemesi olarak da bilinir.

Proteinin asidik bir boyanın protein solüsyonuna eklenmesi ve 595 nmde bir spektrofotometre ya da mikroplate okuyucu ile okunması ilkelerine dayanır. Coomassie Brilliant Blue G-250, boyası, 465 nm ila 595 nm'de proteinin bağlanmasıyla tepki verir.

İlke

Test tubes containing Bradford reagent alone (left) and with lysozyme added (right)

Protein çözümlemesi, asidik koşullarda kırmızı, bağlandığı proteinin bazik olması koşullarında ise maviye dönen Coomassie Brilliant Blue G-250 boyasının renge duyarlı (kolorimetrik) olarak yapıldığı bir yöntemdir.

Bu bileşimin oluşumunda, iki çeşit bağ yer alır: ilkinde Coomassie boyası serbest elektronlarını proteinin iyon gruplarına verir, bu olay proteinin olağan durumunun bozulmasına yol açar ve bu sebeple proteinin hidrofobik bölgeleri açığa çıkar. Proteinin dördüncül yapısındaki bu bölgeler, boyanın kutupsuz bölgelerini van der Waals kuvvetiyle kovalent-olmayan şekilde bağlar ve boyanın negatif yükü yakınındaki pozitif amin gruplarını yeniden konumlandırır. Bu bağ ikinci iyonik etkileşimle daha da güçlendirilir. Proteinin bağlanması Coomassie boyasının mavi formunu sabitler, bu nedenle var olan solüsyonundaki bileşenin miktarı protein yoğunluğunun ölçülmesi için bir orandır ve emilim okunmasıyla saptanabilir.

Boyanın bağlanmış hali en fazla 595 nmde tutulmuştur. Katyonik (bağlanmamış) şekilleri yeşil veya kırmızı olarak görünür. Boyanın proteine bağlanması mavi anyonik formu sabitler. 595 nm emiliminin artışı boyanın miktarıyla orantılıdır ve bu yüzden de örnekteki var olan protein miktarıyla ilişkilidir.

Dezavantajları

Protein çözümlemesi, doğrusal, kısa menzilli bir yöntemdir ve tipik olarak 0 µg/mL ila 2000 µg/mL şeklinde, sıklıkla analizden önce örneklerin dilüsyonu gerektirir. Ayrıca deterjanlar tarafından engellenir.

Doğrusal olmamanın nedeni, proteinin eklenmesiyle karışan boyanın iki formu arasındaki karasızlıktan kaynaklanır.

Bradford protein çözümlemesi, 595 den 450 nm'a kadar olan emilimlerin ölçülmesini doğrusallaştırır. Bu geliştirilmiş assay, geleneksel olandan yaklaşık olarak 10 kez daha duyarlıdır. (Zor & Selinger, 1995)

Prosedür örneği

Materyaller

• Liyofilize bovin plazma gamma globulini
• Coomassie Brilliant Blue 1
• 0.15 M NaCl
• Spektrofotometre ve tüpler
• Mikropipetler

Farklı çözümleme yöntemleri

• Ultraviolet–visible spectroscopy
• Biuret protein assay
• Lowry protein assay
• BCA protein assay
• Amido black protein assay

Kaynakça

• Bradford, M.M. (1976), "Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Anal. Biochem., cilt 72, ss. 248-254, doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3, PMID 942051
• Zor, T.; Selinger, Z. (1996), "Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies", Anal. Biochem., cilt 236, ss. 302-308, doi:10.1006/abio.1996.0171, PMID 8660509
• Noble, J.E.; Bailey, M.J.A. (2009), "Quantitation of Protein", Methods Enzymol., cilt 463, ss. 73-95, doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
• Albright, Brian (2009), Mathematical Modeling with Excel, s. 60, ISBN 978-0763765668
• Stephenson, Frank Harold (2003), Calculations for molecular biology and biotechnology: a guide to mathematics in the laboratory, s. 252, ISBN 0126657513
• Dennison, Clive (2003), "A guide to protein isolation", Focus on structural biology, cilt 3, s. 39, ISBN 1402012241
• Ibanez, Jorge G. (2007), Environmental chemistry: fundamentals, s. 60, ISBN 0387260617

Dış bağlantılar

• Bradford assay chemistry 25 Şubat 2015 tarihinde Wayback Machine sitesinde arşivlendi.
• Variable Pathlength Spectroscopy 19 Aralık 2017 tarihinde Wayback Machine sitesinde arşivlendi.
• OpenWetWare 2 Nisan 2015 tarihinde Wayback Machine sitesinde arşivlendi.
• 19 Mart 2015 tarihinde Wayback Machine sitesinde arşivlendi.

Protein çözümleme 22 Eylül 2017 tarihinde Wayback Machine sitesinde arşivlendi.