Elektron kristalografisi

Elektron kristalografisi, bir transmisyon elektron mikroskobu kullanarak katılardaki atomların düzenini belirleme yöntemidir.

X-ışını kristalografisi ile karşılaştırma

Hem inorganik, organik hem de membran proteinleri gibi çok küçük kristallerin (<0.1 mikrometre) çalışmaları için X ışını kristalografisini tamamlayabilir ve bu işlem için gereken büyük 3 boyutlu kristalleri kolayca oluşturamaz. Protein yapıları genellikle ya 2 boyutlu kristallerden (sheet'ler veya sarmallar), viral kapsidler gibi polihedronlardan ya da dağılmış ayrı proteinlerden belirlenir. Elektronlar bu durumlarda kullanılabilirken, X ışınları kullanılamaz çünkü elektronlar atomlarla X ışınlarından daha güçlü etkileşime girer. Böylelikle, X-ışınları 2 boyutlu ince bir kristalde önemli ölçüde kırınmadan geçerken, elektronlar bir görüntü oluşturmak için kullanılabilir. Tersine, elektronlar ve protonlar arasındaki güçlü etkileşim, kalın (örn. 3 boyutlu>1 mikrometre) kristalleri yalnızca kısa mesafelere nüfuz eden elektronlara karşı geçirimsiz hale getirir.

X-ışını kristalografisindeki ana zorluklardan biri, kırınım modelindeki fazları belirlemektir. X-ışını lenslerinin karmaşıklığından dolayı, kırılan kristalin bir görüntüsünü oluşturmak zordur ve bu nedenle faz bilgisi kaybolur. Neyse ki, elektron mikroskopları atomik yapıyı gerçek uzayda çözebilir ve kristalografik yapı faktör faz bilgisi, bir görüntünün Fourier dönüşümünden deneysel olarak belirlenebilir. Atomik çözünürlüklü bir görüntünün Fourier dönüşümü, bir kristalin simetrisini ve aralığını yansıtan karşılıklı kafes noktalarıyla bir kırınım modeline benzer, ancak farklıdır.^[1] Aaron Klug, faz bilgisinin doğrudan 1968'de bir bilgisayara taranmış bir elektron mikroskobu görüntüsünün Fourier dönüşümünden okunabileceğini ilk fark eden oldu. Bunun için ve virüs yapıları ile transfer-RNA üzerine yaptığı çalışmalar için Klug, 1982'de Nobel Kimya Ödülü'nü aldı.

Radyasyon hasarı

X-ışını kristalografisi ve elektron kristalografisinin ortak bir problemi, radyasyon hasarıdır, özellikle organik moleküller ve proteinler görüntülendikçe zarar görürler ve elde edilebilecek çözünürlüğü sınırlarlar. Bu, radyasyon hasarının çok daha az sayıda atoma odaklandığı elektron kristalografisi ortamında özellikle zahmetlidir. Radyasyon hasarını sınırlamak için kullanılan bir teknik, örneklerin kriyofiksasyona uğradığı ve görüntülemenin sıvı nitrojen veya hatta sıvı helyum sıcaklıklarında gerçekleştiği elektron kriyomikroskopisidir. Bu problem nedeniyle, X-ışını kristalografisi, özellikle radyasyon hasarına karşı savunmasız olan proteinlerin yapısını belirlemede çok daha başarılı olmuştur. Radyasyon hasarı, donmuş hidratlı bir durumda MicroED^[2][3] ince 3D kristalleri kullanılarak yakın zamanda araştırıldı.

Elektron kristalografisi ile belirlenen protein yapıları

Atomik çözünürlüğe ulaşan ilk elektron kristalografik protein yapısı, 1990 yılında Tıbbi Araştırma Konseyi Moleküler Biyoloji Laboratuvarı'nda Richard Henderson ve çalışma arkadaşları tarafından belirlenen bakteriyorodopsin idi.^[4] Bununla birlikte, daha 1975'te Unwin ve Henderson, ilk membran protein yapısını orta çözünürlükte (7 Ångström) belirlemişlerdi ve ilk kez bir membran proteininin iç yapısını, alfa helisleri membranın düzlemine dik olarak duruyorlardı. O zamandan beri, ışık toplama kompleksi,^[5] nikotinik asetilkolin reseptörü^[6] ve bakteri kamçısı dahil olmak üzere elektron kristalografisi ile birçok başka yüksek çözünürlüklü yapı belirlendi.^[7] 2D kristallerin elektron kristalografisi ile çözülen en yüksek çözünürlüklü protein yapısı aquaporin-0 su kanalına aittir.^[8] 2013'te elektron kristalografisi, mikrokristal elektron kırınımı veya MicroED adı verilen yeni bir yöntemle 3B kristallere genişletildi.^[2]

Fourier dönüşümü eklenmiş inorganik tantalum oksidin elektron mikroskobu görüntüsü. Görünümün üst ince bölgeden daha kalın alt bölgeye doğru nasıl değiştiğine dikkat edilir. Bu bileşiğin birim hücresi yaklaşık 15'e 25 Ångström'dür. Simetrinin hesaba katıldığı görüntü işleme sonucunun içinde şeklin merkezinde ana hatlarıyla belirtilmiştir. Siyah noktalar, tüm tantal atomlarını açıkça gösteriyor. Kırınım, 15 Å yönü boyunca 6 sıraya ve dikey yönde 10 sıraya kadar uzanır. Böylece EM görüntünün çözünürlüğü 2,5 Å'dur (15/6 veya 25/10). Bu hesaplanan Fourier dönüşümü hem genlikleri hem de fazları içerir (görüntülenmedi).

Yukarıda gösterilen aynı inorganik tantalum oksit kristalinin elektron kırınım modeli. Burada, yukarıdaki EM görüntüsünden hesaplanan difraktogramdan çok daha fazla kırınım noktası olduğuna dikkat edin. Kırınım, 15 Å yönü boyunca 12 sıraya ve dikey yönde 20 sıraya kadar uzanır. Bu nedenle ED örüntüsünün çözünürlüğü 1.25 Å'dur (15/12 veya 25/20). ED desenleri faz bilgisi içermez, ancak kırınım noktalarının yoğunlukları arasındaki açık farklar kristal yapı belirlemede kullanılabilir.

İnorganik malzemelere uygulama

Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu (HREM) görüntüleri kullanılarak inorganik kristaller üzerindeki elektron kristalografik çalışmaları ilk olarak 1978'de^[9] Aaron Klug ve 1984'te Sven Hovmöller ve çalışma arkadaşları tarafından gerçekleştirildi.^[10] HREM görüntüleri, yapı analizi için kristalin kenarına yakın çok ince bölgelerin seçilmesine (bilgisayar yazılımı ile) izin verdikleri için kullanıldı. Kristalin daha kalın kısımlarında çıkış dalgası işlevi (yansıtılan atom sütunlarının yoğunluğu ve konumu hakkında bilgi taşır) artık yansıtılan kristal yapıyla doğrusal olarak ilişkili olmadığından, bu çok önemlidir. Dahası, HREM görüntüleri sadece artan kristal kalınlığıyla görünümlerini değiştirmekle kalmaz, aynı zamanda objektif lensin bulanıklaştırma f'nin seçilen ayarına da çok duyarlıdır. Bu karmaşıklıkla başa çıkmak için Michael O'Keefe, 1970'lerin başında HREM görüntülerinde gözlemlenen kontrast değişikliklerini yorumlamaya izin veren görüntü simülasyon yazılımı geliştirmeye başladı.^[11]

İnorganik bileşiklerin elektron mikroskobu alanında ciddi bir anlaşmazlık vardı; bazıları "faz bilgisinin EM görüntülerinde mevcut olduğunu" iddia ederken diğerleri "faz bilgisinin EM görüntülerinde kaybolduğu" şeklinde zıt görüşe sahiptir. Bu zıt görüşlerin nedeni, fizikçiler ve kristalograflardan oluşan iki toplulukta "faz" kelimesinin farklı anlamlarla kullanılmış olmasıdır. Fizikçiler daha çok "elektron dalga fazı" ile ilgileniyorlar - elektronların maruz kalması sırasında örnekte hareket eden bir dalganın fazı. Bu dalganın dalga boyu yaklaşık 0.02-0.03 Ångström'dür (elektron mikroskobunun hızlanan voltajına bağlı olarak). Onun fazı, kırılmamış direkt elektron ışınının fazıyla ilgilidir. Öte yandan kristalograflar, basitçe "faz" dedikleri zaman "kristalografik yapı faktör fazı" anlamına gelir. Bu aşama, kristaldeki durağan potansiyel dalgalarının aşamasıdır (X-ışını kristalografisinde ölçülen elektron yoğunluğuna çok benzer). Bu dalgaların her biri, düşük/yüksek potansiyelli Bragg düzlemleri arasındaki mesafe için d-değeri olarak adlandırılan kendi özel dalga boyuna sahiptir. Bu d-değerleri, birim hücre boyutlarından elektron mikroskobunun çözünürlük sınırına, yani tipik olarak 10 veya 20 Ångströms'den 1 veya 2 Ångströms'e kadar değişir. Aşamaları, kristalin simetri elemanlarıyla ilişkili olarak tanımlanan kristaldeki sabit bir noktayla ilişkilidir. Kristalografik fazlar kristalin bir özelliğidir, dolayısıyla elektron mikroskobunun dışında da bulunurlar. Mikroskop kapatılırsa elektron dalgaları kaybolur. Bir kristal yapının belirlenebilmesi için kristalografik yapı faktörlerinin bilinmesi ancak elektron dalga fazlarının bilinmemesi gerekir. Fazların elektron dalgasının fazlarıyla (kristalografik yapı faktörü) nasıl bağlantılı olduğu daha ayrıntılı bir tartışmada bulunabilir.^[12]

Tıpkı proteinlerde olduğu gibi, inorganik kristallerin atomik yapılarını da elektron kristalografisi ile belirlemek mümkün olmuştur. Daha basit yapı için, üç dikey görünüşün kullanılması yeterlidir, ancak daha karmaşık yapılar için, on veya daha fazla farklı köşegen aşağıya projeksiyonlar da gerekli olabilir.

Elektron mikroskobu görüntülerine ek olarak, kristal yapı tayini için elektron kırınım (ED) modellerini kullanmak da mümkündür.^[13][14] Yansımalar (yarı kinematik kırınım koşulları) arasındaki yapı ile ilgili yoğunluk farklılıklarının çoğunu korumak için bu tür ED modellerini en ince alanlardan kaydetmek için azami özen gösterilmelidir. X-ışını kırınım modellerinde olduğu gibi, önemli kristalografik yapı faktör fazları elektron kırınım modellerinde kaybolur ve doğrudan yöntemler, maksimum olasılık (son zamanlarda) veya yük çevirme yöntemi gibi özel kristalografik yöntemlerle ortaya çıkarılmalıdır. Öte yandan, inorganik kristallerin ED modelleri genellikle 1 Ångström'ün çok altında yüksek bir çözünürlüğe (yüksek Miller indeksli düzlemler arası boşluklar) sahiptir. Bu, en iyi elektron mikroskoplarının nokta çözünürlüğü ile karşılaştırılabilir. Uygun koşullar altında, tam kristal yapıyı belirlemek için tek bir yönelimden ED modellerini kullanmak mümkündür.^[15] Alternatif olarak, kristal yapıyı iyileştirmek için ED'den gelen yoğunlukları ve çözme için HRTEM görüntülerini kullanan bir hibrit yaklaşım kullanılabilir.^[16][17]

ED tarafından yapı analizi için son gelişmeler, elektron kırınım modellerini kaydetmek için Vincent-Midgley presesyon tekniğinin tanıtılmasıyla gerçekleştirildi.^[18] Bu şekilde elde edilen yoğunluklar genellikle kinematik yoğunluklara çok daha yakındır, böylece geleneksel (seçili alan) elektron kırınım verileri işlenirken aralık dışı olan yapılar bile belirlenebilir.^[19][20]

Elektron kristalografisi ile belirlenen kristal yapılar, yoğunluk fonksiyonel teorisi (DFT) dahilinde birinci prensip hesaplamaları kullanılarak kaliteleri kontrol edilebilir. Bu yaklaşım ilk kez, sırasıyla yalnızca HRTEM ve ED tarafından erişilebilen birkaç metal açısından zengin yapının doğrulanması için uygulandı.^[21][22]

Son zamanlarda, X-ışını toz kırınımı ile birleştirilen elektron kristalografisi ile iki çok karmaşık zeolit yapısı belirlenmiştir.^[23][24] Bunlar, X-ışını kristalografisi ile belirlenen en karmaşık zeolit yapılardan daha karmaşıktır.

Kaynakça

1. R Hovden; Y Jiang; HL Xin; LF Kourkoutis (2015). "Periodic Artifact Reduction in Fourier Transforms of Full Field Atomic Resolution Images". Microscopy and Microanalysis. 21 (2). ss. 436-441. Bibcode:2015MiMic..21..436H. doi:10.1017/S1431927614014639. PMID 25597865.
2. Nannenga, Brent L; Shi, Dan; Leslie, Andrew G W; Gonen, Tamir (3 Ağustos 2014). "High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED". Nature Methods. 11 (9). ss. 927-930. doi:10.1038/nmeth.3043. ISSN 1548-7091. PMC 4149488 $2. PMID 25086503.
3. Hattne, Johan; Shi, Dan; Glynn, Calina; Zee, Chih-Te; Gallagher-Jones, Marcus; Martynowycz, Michael W.; Rodriguez, Jose A.; Gonen, Tamir (2018). "Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM". Structure. 26 (5). ss. 759-766.e4. doi:10.1016/j.str.2018.03.021. ISSN 0969-2126. PMC 6333475 $2. PMID 29706530.
4. Henderson, R.; Baldwin, J.M.; Ceska, T.A.; Zemlin, F; Beckmann, E.; Downing, K.H. (Haziran 1990). "Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy". J Mol Biol. 213 (4). ss. 899-929. doi:10.1016/S0022-2836(05)80271-2. PMID 2359127.
5. Kühlbrandt, Werner; Wang, Da Neng; Fujiyoshi, Yoshinori (Şubat 1994). "Atomic model of plant light-harvesting complex by electron crystallography". Nature. 367 (6464). ss. 614-21. Bibcode:1994Natur.367..614K. doi:10.1038/367614a0. PMID 8107845.
6. Miyazawa, Atsuo; Fujiyoshi, Yoshinori; Unwin, Nigel (Haziran 2003). "Structure and gating mechanism of the acetylcholine receptor pore". Nature. 423 (6943). ss. 949-55. Bibcode:2003Natur.423..949M. doi:10.1038/nature01748. PMID 12827192.
7. Yonekura, Koji; Maki-Yonekura, Saori; Namba, Keiichi (Ağustos 2003). "Complete atomic model of the bacterial flagellar filament by electron cryomicroscopy". Nature. 424 (6949). ss. 643-50. Bibcode:2003Natur.424..643Y. doi:10.1038/nature01830. PMID 12904785.
8. Gonen, Tamir; Cheng, Yifan; Sliz, Piotr; Hiroaki, Yoko; Fujiyoshi, Yoshinori; Harrison, Stephen C.; Walz, Thomas (2005). "Lipid–protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals". Nature. 438 (7068). ss. 633-638. Bibcode:2005Natur.438..633G. doi:10.1038/nature04321. ISSN 0028-0836. PMC 1350984 $2. PMID 16319884.
9. Klug, A (1978/79) Image Analysis and Reconstruction in the Electron Microscopy of Biological Macromolecules Chemica Scripta vol 14, p. 245-256.
10. Hovmöller, Sven; Sjögren, Agneta; Farrants, George; Sundberg, Margareta; Marinder, Bengt-Olov (1984). "Accurate atomic positions from electron microscopy". Nature. 311 (5983). s. 238. Bibcode:1984Natur.311..238H. doi:10.1038/311238a0.
11. O'Keefe, M. A.; Buseck, P. R.; Iijima, S. (1978). "Computed crystal structure images for high resolution electron microscopy". Nature. 274 (5669). s. 322. Bibcode:1978Natur.274..322O. doi:10.1038/274322a0.
12. Zou, X (1999). "On the phase problem in electron microscopy: the relationship between structure factors, exit waves, and HREM images". Microscopy Research and Technique. 46 (3). ss. 202-19. doi:10.1002/(SICI)1097-0029(19990801)46:3<202::AID-JEMT4>3.0.CO;2-8. PMID 10420175.
13. B. K. Vainshtein (1964), Structure Analysis by Electron Diffraction, Pergamon Press Oxford
14. D. L. Dorset (1995), Structural Electron Crystallography, Plenum Publishing Corporation 0-306-45049-6
15. Weirich, TE; Zou, X; Ramlau, R; Simon, A; Cascarano, GL; Giacovazzo, C; Hovmöller, S (2000). "Structures of nanometre-size crystals determined from selected-area electron diffraction data". Acta Crystallographica A. 56 (Pt 1). ss. 29-35. doi:10.1107/S0108767399009605. PMID 10874414.
16. Zandbergen, H. W. (1997). "Structure Determination of Mg5Si6 Particles in Al by Dynamic Electron Diffraction Studies". Science. 277 (5330). ss. 1221-1225. doi:10.1126/science.277.5330.1221.
17. Weirich, Thomas E.; Ramlau, Reiner; Simon, Arndt; Hovmöller, Sven; Zou, Xiaodong (1996). "A crystal structure determined with 0.02 Å accuracy by electron microscopy". Nature. 382 (6587). s. 144. Bibcode:1996Natur.382..144W. doi:10.1038/382144a0.
18. "Precession Electron Diffraction". 24 Eylül 2018 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 17 Kasım 2020.
19. Gemmi, M; Zou, X; Hovmöller, S; Migliori, A; Vennström, M; Andersson, Y (2003). "Structure of Ti2P solved by three-dimensional electron diffraction data collected with the precession technique and high-resolution electron microscopy". Acta Crystallographica. 59 (Pt 2). ss. 117-26. doi:10.1107/S0108767302022559. PMID 12604849.
20. Weirich, T; Portillo, J; Cox, G; Hibst, H; Nicolopoulos, S (2006). "Ab initio determination of the framework structure of the heavy-metal oxide CsxNb2.54W2.46O14 from 100kV precession electron diffraction data". Ultramicroscopy. 106 (3). ss. 164-75. doi:10.1016/j.ultramic.2005.07.002. PMID 16137828.
21. Albe, K; Weirich, TE (2003). "Structure and stability of alpha- and beta-Ti2Se. Electron diffraction versus density-functional theory calculations". Acta Crystallographica A. 59 (Pt 1). ss. 18-21. doi:10.1107/S0108767302018275. PMID 12496457.
22. Weirich, TE (2004). "First-principles calculations as a tool for structure validation in electron crystallography". Acta Crystallographica A. 60 (Pt 1). ss. 75-81. Bibcode:2004AcCrA..60...75W. doi:10.1107/S0108767303025042. PMID 14691330.
23. Gramm, Fabian; Baerlocher, Christian; McCusker, Lynne B.; Warrender, Stewart J.; Wright, Paul A.; Han, Bada; Hong, Suk Bong; Liu, Zheng; Ohsuna, Tetsu; Terasaki, Osamu (2006). "Complex zeolite structure solved by combining powder diffraction and electron microscopy". Nature. 444 (7115). ss. 79-81. Bibcode:2006Natur.444...79G. doi:10.1038/nature05200. PMID 17080087.
24. Baerlocher, C.; Gramm, F.; Massuger, L.; McCusker, L. B.; He, Z.; Hovmoller, S.; Zou, X. (2007). "Structure of the Polycrystalline Zeolite Catalyst IM-5 Solved by Enhanced Charge Flipping". Science. 315 (5815). ss. 1113-6. Bibcode:2007Sci...315.1113B. doi:10.1126/science.1137920. PMID 17322057.