Loading AI tools
Из Википедии, свободной энциклопедии
Пиросеквени́рование — это метод секвенирования ДНК (определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК), основанный на принципе «секвенирование путём синтеза». При включении нуклеотида происходит детекция высвобождающихся пирофосфатов[1]. Технология была разработана Полом Ниреном[англ.] (швед. Pål Nyrén) и его студентом Мустафой Ронаги[англ.] англ. Mostafa Ronaghi) в Королевском технологическом институте (Стокгольм) в 1996 году[2][3][4].
Идея пиросеквенирования заключается в регистрации пирофосфата, который образуется при присоединении очередного нуклеотида ДНК-полимеразой. Детекция пирофосфата осуществляется за счёт каскада химических реакций, который заканчивается выделением кванта света[5].
Прежде всего создаётся иммобилизованная на твёрдой фазе клональная библиотека[англ.] одноцепочечных фрагментов ДНК (например, при помощи мостиковой полимеразной цепной реакции, ПЦР). Ко всем фрагментам ДНК присоединяется адаптер, с которым будет комплементарно связываться праймер — затравка для синтеза комплементарной цепи ДНК-полимеразой. Далее производится серия последовательных циклов, в процессе которых к закреплённой на твёрдой фазе ДНК по очереди добавляют дезоксинуклеотидтрифосфаты всех четырёх типов: A, T, G, C. Если на секвенируемой цепи ДНК есть комплементарный к добавленному нуклеотид, то при образовании фосфодиэфирной связи побочным продуктом станет пирофосфат. Он активирует каскад химических реакций: пирофосфат вместе с аденозинсульфофосфатом (АСФ) при помощи фермента АТФ-сульфурилазы[англ.] образуют АТФ, который является источником энергии для проведения реакции окисления люциферина в оксилюциферин с выделением кванта света. Интенсивность выделяемого света пропорциональна числу включённых в цепь нуклеотидов (чем больше подряд одинаковых нуклеотидов, тем сильнее световой сигнал). Детекция света осуществляется ПЗС-матрицей и анализируется с помощью программного обеспечения, которое строит по пирограмме последовательность нуклеотидов. Нуклеотиды, не вовлечённые в синтез новой цепи, а также АТФ разрушаются ферментом апиразой[англ.]. После этого начинается следующий цикл, то есть добавляется нуклеотид другого типа[6].
Позднее Маргулис и соавторы предложили сочетание пиросеквенирования с эмульсионной ПЦР[7].
Компания Pyrosequencing AB, которая располагается в Уппсале, Швеция, коммерциализовала технологию и реагенты для секвенирования коротких участков ДНК. В 2003 году Pyrosequencing AB переименована в «Biotage». В 2008 году Qiagen приобрел Biotage[8]. На принципе пиросеквенирования основана коммерческая технология 454 Life Sciences (компания Roche Applied Science[англ.])[7].
По сравнению с секвенированием по Сэнгеру, пиросеквенирование выгодно отличается стоимостью, а также тем, что за один раз можно получить сотни тысяч прочтений[англ.]. Однако пиросеквенирование имеет и ряд недостатков. Так, с помощью этого метода невозможно безошибочно секвенировать протяжённые участки, состоящие из одного и того же нуклеотида. Кроме того, оно позволяет получать лишь прочтения небольшой длины. Четвёртое поколение технологий пиросеквенирования, например, GS FLX Titanium, позволяет получать прочтения длиной более 400 пар оснований[9].
Seamless Wikipedia browsing. On steroids.
Every time you click a link to Wikipedia, Wiktionary or Wikiquote in your browser's search results, it will show the modern Wikiwand interface.
Wikiwand extension is a five stars, simple, with minimum permission required to keep your browsing private, safe and transparent.
