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미생물 판별을 위한 염색법 중 하나 위키백과, 무료 백과사전
그람 염색(영어: Gram stain 또는 Gram staining) 또는 그람 염색법(영어: Gram's method)은 미생물학 및 세균학에서 세균을 그람양성세균과 그람음성세균의 두 가지 큰 부류로 분류하는 데 사용하는 염색 방법이다. 1884년에 이 기법을 개발한 덴마크의 세균학자인 한스 크리스티안 그람의 이름을 따서 명명되었다.[1]
그람 염색은 세포벽의 화학적 특성 및 물리적 특성의 차이를 이용해 세균을 구별하는 방법이다. 그람양성세균은 세포벽에 두꺼운 펩티도글리칸 층을 가지고 있어서 1차 염색제인 크리스탈 바이올렛을 머금을 수 있다. 그람음성세균은 보다 얇은 펩티도글리칸 층을 가지고 있어서 에탄올로 세척하면 크리스탈 바이올렛이 씻겨 나간다. 그람음성세균은 일반적으로 사프라닌 또는 푸크신을 이용한 대비염색에 의해 분홍색 또는 빨간색으로 염색된다.[2] 아이오딘-아이오딘화 칼륨 용액(루골 용액)은 세포막과 염색액의 결합을 강화하기 위해 크리스탈 바이올렛을 사용한 후에 항상 첨가된다.
그람 염색은 거의 대부분에서 세균의 부류를 식별하는 첫 번째 단계이다. 그람 염색은 임상 및 연구 환경 모두에서 귀중한 진단 도구이지만 모든 세균들이 그람 염색으로 명확하게 분류될 수 있는 것은 아니다. 이것은 그람가변세균 및 그람불확정세균을 발생시킨다.
그람 염색이라 명칭은 1884년에 베를린의 시립 병원의 영안실에서 카를 프리들란더와 함께 근무하면서 이 방법을 개발한 덴마크의 세균학자인 한스 크리스티안 그람의 이름을 따서 명명되었다. 그람은 세균을 다른 종과 구별하기 위한 목적이 아니라 폐 조직의 염색된 부분에서 세균을 더 잘 보이도록 하기 위해 이 방법을 고안했다.[3] 그람은 1884년에 자신이 고안한 방법을 발표했으며, 그의 짧은 보고서에서 발진티푸스 간균이 염색되지 않는다는 관찰 내용을 포함시켰다.[4]
그람 염색은 세포벽의 물리적, 화학적 특성에 따라 세균 종을 두 개의 큰 부류(그람양성세균과 그람음성세균)으로 구별하는 데 사용되는 세균학적 실험 기술이다.[5][6] 그람 염색은 고세균을 분류하는 데 사용되지 않는다. 이러한 미생물은 계통발생학적 분류군을 따르지 않는 매우 다양한 반응을 나타내기 때문이다.[7]
일부 세균들은 그람 가변적(그람음성 또는 그람양성으로 염색될 수 있음을 의미)이다. 일부 세균들은 그람 염색법에 사용된 염료로 염색되지 않고 보이지 않는다. 현대의 환경 또는 분자미생물학 연구실에서 대부분의 식별은 유전자 서열 및 기타 분자 기술을 사용하여 이루어지며, 이는 차등 염색보다 훨씬 더 구체적이고 유익한 정보를 제공한다.
그람 염색은 감염이 의심될 때 체액 또는 생검으로 수행된다. 그람 염색은 배양보다 훨씬 더 빨리 결과가 나오며 감염이 환자의 치료와 예후에 중요한 차이를 만들 때 특히 중요하다. 수막염의 경우 뇌척수액, 패혈성 관절염의 경우 활액이 그 예이다.[8][9]
그람양성세균은 펩티도글리칸(세포외막의 50~90%)으로 이루어진 그물망 형태의 두꺼운 세포벽을 가지고 있으며, 그 결과 크리스탈 바이올렛에 의해 보라색으로 염색된다. 반면에 그람음성세균은 더 얇은 층(세포외막의 10%)을 가지기 때문에 보라색 염색을 유지하지 못하고 사프라닌에 의해 분홍색으로 대비염색된다. 그람 염색의 4가지 기본 단계는 다음과 같다.
크리스탈 바이올렛(CV)은 수용액에서 CV+
및 염화물(Cl−
) 이온으로 해리된다. 이들 이온은 그람양성세균 및 그람음성세균의 세포벽을 관통한다. CV+
이온은 세균 세포의 음전하 부분과 상호작용하여 세포를 보라색으로 염색한다.[12]
아이오딘화물(I−
또는 I−
3)은 CV+
와 상호작용하여 세포의 내층과 외층 내에서 크리스탈 바이올렛과 아이오딘의 거대 복합체(CV–I)를 형성한다. 아이오딘은 보통 매염제로 언급되지만, CV–I 복합체의 제거를 방지하여 세포를 착색시키는 포획제이다.[13]
에탄올이나 아세톤과 같은 탈색제가 첨가되면 세포막의 지질과 상호작용한다.[14] 그람음성세균은 외부의 지질다당류 막을 잃고 내부의 펩티도글리칸 층이 노출된 상태로 남는다. CV–I 복합체는 외막과 함께 그람음성세균에서 세척된다.[15] 대조적으로 그람양성세균은 에탄올 처리로 인해 탈수된다. 거대 CV–I 복합체는 펩티도글리칸의 다층 특성으로 인해 그람양성세균 내에 갇히게 된다.[15] 탈색 단계는 매우 중요하며 시간을 정확하게 맞춰야 한다. 탈색제를 너무 오래(몇 초) 방치하면 크리스탈 바이올렛 염색이 그람양성세균과 그람음성세균 모두에서 제거된다.[16]
탈색 후 그람양성세균은 보라색을 유지하며 그람음성세균은 보라색을 잃게 된다.[16] 일반적으로 양전하를 띤 사프라닌 또는 염기성 푸크신으로 대비염색을 마지막에 수행하여 탈색된 그람음성세균을 분홍색 또는 빨간색으로 만든다.[2][17] 그람양성세균과 그람음성세균 모두에 대비염색을 한다. 그러나 대비염색을 해도 크리스탈 바이올렛 염색이 더 진하기 때문에 그람양성세균은 여전히 보라색을 띠게 된다.
그람양성세균은 일반적으로 두꺼운 펩티도글리칸으로 둘러싸인 단일막을 가지고 있다. 이러한 것은 후벽균문(몰리쿠테스강과 네가티비쿠테스강은 제외)과 방선균문의 두 개의 문에서 적용된다.[6][18] 대조적으로 녹만균류(녹색비황세균)의 구성원들은 단일막이지만 얇거나 없는(데할로콕코이데스강) 펩티도글리칸을 가지고 있으며, 음성, 양성 또는 불확실하게 염색될 수 있다. 데이노코쿠스문은 양성으로 염색되지만 두꺼운 펩티도글리칸을 가진 2개의 막을 가지고 있다.[6][18]
역사적으로 그람양성세균은 현재 가장 큰 그룹에 사용되는 이름인 후벽균문(Firmicutes)을 구성했다. 여기에는 락토바실루스속, 바실루스속, 리스테리아속, 포도상구균속, 연쇄상구균속, 장내구균속, 클로스트리디움속과 같은 잘 알려져 있는 많은 속들이 포함되어 있다.[19] 또한 미코플라스마 및 테르모플라스마와 같은 세포벽이 없어서 그람 염색이 불가능하지만 그러한 형태에서 파생된 세균인 몰리쿠테스강강을 포함하도록 확정되었다.[20]
일부 세균은 염색을 유지하는 데 특히 유리한 세포벽을 가지고 있다. 이들은 다른 그람양성세균과 밀접하게 관련되어 있지 않더라도 그람 염색에서 양성으로 나타난다. 이들은 항산균이라고 하며, 특수한 염색 절차(질-닐슨 염색)을 통해서 다른 그람양성세균과 구별할 수 있다.[21]
그람음성세균은 일반적으로 두 개의 막(diderm) 사이에 얇은 펩티도글리칸 층을 가지고 있다.[22] 지질다당류(LPS)는 대부분의 그람음성세균의 세포 표면에 가장 풍부한 항원으로 대장균과 살모넬라균의 외막의 최대 80%까지 차지한다.[23] 대부분의 세균의 문은 남세균, 녹색황세균 및 대부분의 프로테오박테리아를 포함(예외는 리케차목의 일부 구성원 및 장내세균목의 곤충-내공생균)하여 그람 음성이다.[6][18]
일부 세균은 그람 염색으로 염색한 후에 분홍색과 보라색 세포가 혼합되어 보이는 그람가변패턴을 나타낸다.[15][24] 바실루스, 부티리비브리오, 클로스트리디움의 배양에서 생장하는 동안 펩티도글리칸의 두께 감소는 그람음성으로 염색되는 세포 수의 증가와 일치한다.[24] 또한 그람 염색을 이용하여 염색한 모든 세균은 배양 시간이 염색 결과에 영향을 미칠 수 있다.[24]
그람불확정세균은 그람 염색에 예상대로 반응하지 않기 때문에 그람양성세균 또는 그람음성세균으로 결정할 수 없다. 예를 들면 소결핵균(Mycobacterium bovis), 나균(Mycobacterium leprae), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 포함하여 많은 종의 미코박테리움이 포함되며, 나균 및 결핵균은 각각 나병 및 결핵의 원인 병원체이다.[25][26] 미코플라스마속의 세균은 세포막 주위에 세포벽이 없기 때문에[8] 그람 염색법으로 염색되지 않으며, 세포벽 합성을 표적으로 하는 항생제에 내성을 나타낸다.[27][28]
그람 염색(Gram stain)이라는 용어는 한스 크리스티안 그람의 이름에서 유래되었다. 따라서 그람(Gram)은 대문자로 표시되지만 과학 용어에서 일반적으로 사용되는 일반 명사인 염색(stain)은 대문자로 표시하지 않는다.[29] 명칭의 시조가 되는 형용사인 그람양성 및 그람음성의 첫 문자는 작성 중인 문서를 관리하는 스타일 가이드가 있는 경우에 따라 대문자 G 또는 소문자 g가 될 수 있다. 소문자 스타일은 미국 질병통제예방센터 및 AMA 스타일 등에서 사용된다.[30] 사전은 소문자,[31][32] 대문자[33][34][35][36] 또는 둘 다[37][38]를 사용할 수 있다. 그람양성 또는 그람음성의 대문자 표기는 많은 과학 저널 기사 및 간행물에서 일반적으로 사용된다.[38][39][40] 논문이 저널에 제출되면 각 저널은 포스트프린트 버전에 하우스 스타일을 적용하거나 적용하지 않을 수 있다. 프리프린트 버전에는 저자가 우연히 사용한 스타일이 포함되어 있다. 형용사인 그람양성(gram-positive) 및 그람음성(gram-negative)에 소문자를 사용하는 스타일의 용법에서 조차도 일반적으로 그람 염색(Gram stain)에 대해서는 대문자를 사용한다.
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