Kaley è la primogenita di Gary Carmine Cuoco, un agente immobiliare statunitense di origini italiane, e di Layne Ann Wingate, una casalinga di origini tedesche e inglesi; ha una sorella, Briana[2][3][4] anch'essa attrice e cantante.
Da bambina, Kaley Cuoco era una tennista amatoriale, sport che ha iniziato quando aveva tre anni. Ha smesso di praticare tale sport all'età di 16 anni per intraprendere la carriera di attrice.[5]
La sua carriera di attrice è cominciata nel 1992 con il film Senza via d'uscita. Il suo ruolo di Marcia Brady in Growing Up Brady (2000) ha attirato l'attenzione della critica, così come la successiva parte nella sitcom Ladies Man. Nel 2004, oltre al ruolo di protagonista in 8 semplici regole, ha partecipato alla miniserie Magnitudo 10.5, al film TV Crimini con stile nonché alla pellicola indipendente Debating Robert Lee. L'anno dopo ha fatto parte del cast della serie televisiva Streghe impersonando Billie Jenkins. Dal 2007 al 2019 è tra i protagonisti dell'acclamata sitcom The Big Bang Theory.
Nel 2004, Kaley è stata nominata la settantaquattresima donna più sexy degli Stati Uniti al FHM-US's 100 Sexiest Women. Nello stesso anno, nella versione americana del cartone animato di Disney ChannelBrandy and Mr. Whiskers, Kaley ha doppiato il personaggio Brandy Harrington. Sempre nel 2004, è stata co-protagonista con Nick Carter e Kevin Zegers nel film The Hollow. Kaley ha anche doppiato una delle due "gemelle in rosa" nel gioco per PlayStationBratz.
Ha condotto la cerimonia di premiazione dei Teen Choice Awards 2011, e quelle dei People's Choice Awards 2012 e 2013. Sempre nel 2013 la rivista Forbes la inserisce al secondo posto tra le attrici più pagate della TV, con un guadagno di undici milioni di dollari;[6] dal 2014, dopo il rinnovo del suo contratto con la sitcom The Big Bang Theory, percepisce un assegno di oltre un milione di dollari a episodio, diventando (assieme ai colleghi di set Johnny Galecki e Jim Parsons) tra gli attori televisivi più pagati di sempre.[7] Nello stesso anno, in novembre riceve una stella sulla Hollywood Walk of Fame.[8]
Nell'ottobre 2017, Kaley Cuoco ha fondato la Yes, Norman Productions, una società di produzione televisiva che ha stipulato un accordo di produzione pluriennale esclusivo con Warner Bros. Television.
Nel 2023 Kaley Cuoco ha fondato il marchio "Oh Norman!" che produce e commercializza prodotti per gli animali, ed in particolare per i cani; il nome è stato scelto in onore del pitbull morto nel 2021 a cui l'attrice era molto affezionata.[10]
In varie interviste l'attrice ha affermato di aver fatto un intervento di chirurgia plastica al seno e al naso all'età di 18 anni, mentre recitava nella sitcom 8 semplici regole, definendola "la migliore decisione che abbia mai preso".[11][12][13]
Dal 2007 al 2009 ha avuto una relazione con il collega Johnny Galecki,[14] conosciuto sul set di The Big Bang Theory. Il 31 dicembre 2013 ha sposato il tennista Ryan Sweeting, conosciuto nell'agosto precedente,[15] da cui ha poi divorziato nel settembre 2015;[16] durante il matrimonio ha aggiunto il cognome del marito al suo, facendosi accreditare in quegli anni come Kaley Cuoco-Sweeting.
Nel settembre 2010 è rimasta vittima di un incidente a cavallo che le ha procurato una frattura della gamba destra: inizialmente i medici, pensando a un'infezione, avevano previsto l'amputazione del piede destro, ipotesi successivamente rientrata.[17]
Nel 2016 ha iniziato una relazione con il fantino professionista Karl Cook, con il quale si è fidanzata ufficialmente l'anno dopo,[18] per poi sposarsi nel giugno 2018.[19] La coppia è rimasta legata fino al settembre 2021, quando ha annunciato il divorzio.[20]
Si è legata in seguito al collega Tom Pelphrey, da cui ha avuto una figlia nel marzo 2023.[21] La coppia si è fidanzata ufficialmente nell'estate 2024.[22]