פלואורופור

פלואורופור (או פלואורוכרום, בדומה לכרומופור, באנגלית: fluorophore) הוא תרכובת כימית פלואורסצנטית שכאשר מעוררים אותה באמצעות אור באורך גל מסוים, פולטת אור באורך גל שונה, ארוך יותר. פלואורופורים מכילים בדרך כלל כמה קבוצות ארומטיות או מולקולות עם כמה קשרי π.^[1]

פלואורסצנציה של ארבעה חומרים שונים תחת תאורת UV. הירוק הוא פלואורוסצאין (אנ'), האדום הוא רודמין B (אנ'), הצהוב הוא רודמין 6G (אנ') והכחול הוא כינין. ריכוז החומרים בתמיסות (שרובן מים) המוצגות הוא כ-0.001 אחוז.

לפלואורופור מספר יישומים:

• עקיבה אחר זרימת נוזלים
• כצבען בתהליך הכתמת מבנים ביולוגיים במיקרוסקופיה.
• מצע לאנזימים
• כאינדיקטור- כאשר הפלואורסצנציה שלו מושפעת מתופעות סביבתיות כגון קיטוב או יונים.

בדרך כלל, הפלואורופור נקשר קוולנטית למקרומולקולה, ומשמש כסמן ביולוגי עבור מגיבים (נוגדנים, פפטידים, חומצות גרעין). שימושו העיקרי של הפלואורופור, הכתמת רקמות, תאים, או חומרים נעשה במגוון שיטות אנליטיות כגון דימות פלואורסצנטי וספקטרוסקופיה.^[2][3][4]

הסבר פיזיקלי

ערך מורחב – פלואורסצנציה

דיאגרמת יבלונסקי חלקית: בליעה, דעיכה לא קרינתית ופלואורסצנציה (מעבר בין תת-רמת אנרגיה ויברציונית בתוך רמת הסינגלט, S1 לתת רמת אנרגיה ויברציונית בתוך רמת היסוד, S0)

ספקטרום בליעה ופליטה של רודמין 6G (אנ') עם היסט סטוקס של 25nm.

הפלואורופור בולע אנרגיית אור באורך גל מסוים ופולט אור באורך גל ארוך יותר. אורכי הגל הנבלעים, נצילות העברת האנרגיה והזמן לפני הפליטה תלויים הן במבנה הפלואורופור והן בסביבה הכימית שלו, כאשר המולקולה במצב המעורר מקיימת אינטראקציה עם המולקולות הסובבות.

המונחים האופייניים המשמשים להתייחסות לפלואורופור נתון הם אורכי גל לבליעה מקסימלית ופליטה מקסימלית אך יש חשיבות גם לספקטרום כולו. ספקטרום אורך הגל עשוי להיות פס צר מאוד או רחב מאוד, או מעבר לאורך הגל המתאים לתדר הקיטעון.

בדרך כלל, ספקטרום הפליטה חד יותר מספקטרום הבליעה/עירור, בעל טווח אורכי גל גדולים יותר ואנרגיות נמוכות יותר בהתאמה. טווח אנרגיות העירור נע בין אולטרה סגול לבין האור הנראה, ואילו טווח אנרגיות הפליטה נע בין האור הנראה לבין האינפרא אדום.

המאפיינים העיקריים של פלואורופורים הם:

• אורך גל לבליעה ולפליטה מקסימליות - מתאים ל"פיק" בספקטרומי הבליעה והפליטה.
• מקדם הנחתה (או בליעה מולרית, ביחידות של 1 חלקי סנטימטר כפול 1 חלקי מול) - היחס בין כמות האור הנבלעת, באורך גל נתון, לבין ריכוז הפלואורופור בתמיסה.
• נצילות קוונטית: הנצילות של האנרגיה המועברת מהאור הפוגע לקרינה הנפלטת (היחס בין מספר הפוטונים הנפלטים למספר הפוטונים שנבלעו).
• זמן חיים (בפיקושניות): משך זמן המצאות הפלואורופור במצב מעורר עד חזרה למצב היסוד. זמן זה נמדד כזמן הדעיכה של אוכלוסיית האלקטרונים במצב המעורר לכדי (${\displaystyle \approx 0.368}$) ${\displaystyle 1/e}$מהאוכלוסייה המקורית.
• היסט סטוקס: ההפרש (בננומטר) בין אורכי הגל של הבליעה והפליטה המקסימליות.

מאפיינים נוספים הם ליבון אופטי או התנגדות אופטית, קיטוב פלואורסצנטי, אנאיזוטרופיות (המושפעת מגודל וצורת המולקולה).

פלואורופור יכול לשמש גם כמדכא קרינה פלואורסצנטית (אנ') של צבענים פלואורסצנטיים אחרים או להעביר את הפלואורסצנציה לאורך גל גדול יותר על ידי FRET.

גודל (משקל מולקולרי)

רוב הפלואורופורים מורכבים ממולקולות אורגניות קטנות שמכילות 20–100 אטומים (200–1000 דלטון - המשקל המולקולרי עשוי להיות גבוה יותר בהתאם לשינויים בתרכובות, ומולקולות מצומדות). לעומת זאת, הפלואורופורים הטבעיים, החלבונים, הרבה יותר גדולים כגון ה-GFP שמשקלו המולקולרי הוא 27 אלף דלטון.

הגודל יכול לגרום לאפקט סטרי ולהשפיע על הקיטוב הפלואורסצנטי.

סיווג

חלבונים פלואורוסצנטיים בתחום האינפרא אדום (SmURFP (אנ')) מבוססי אוביקוויטין ממחישים את התקדמות מחזור התא.

ניתן לסווג את הפלואורופורים ל-2 קבוצות עיקריות:

1. פלואורופורים פנימיים (Intrinsic Fluorophores) - פלואורסצנציה מתרחשת באופן טבעי.
2. פלואורופורים חיצוניים (Extrinsic Fluorophores) - צבענים סינתטיים או ביוכימיקליים מהונדסים שמוסיפים לדגימה על מנת לייצר פלואורסצנציה עם מאפיינים ספקטרליים ספציפיים.

פלואורופורים פנימיים

חומצות אמינו ארומטיות - כגון: פנילאלנין, טירוזין, טריפטופן

אנזימים - כגון: NAD, כלורופיל

פלואורופורים חיצוניים

משמשים באחת מ-2 צורות:

• זיהוי פלואורסצנטי (Fluorescent Probes) - אינטראקציה לא-קוולנטית.
• תיוג פלואורסצנטי (Fluorescent Labels) - אינטראקציה קוולנטית

מתחלקים לחמישה סוגים:^[5][6]

• חלבונים פלואורסצנטיים - כגון:
  • GFP (ירוק), YFP (צהוב) ו-RFP (אדום) אשר מצומדים לחלבונים מסוימים אחרים כדי ליצור חלבון כימרי ומסונתזים לתוך תאים אחרי טרנספקציה של פלסמיד נושא.
  • חלבוני פיקובילין (אנ') המבודדים מאדומיות:
    • פיקוארתרין (אנ') : RPE (אדום) ו-BPE (כחול), פיקוציאנין (אנ'), CPC ואלופיקוציאנין (אנ'), APC.
• צבענים אורגניים - משתייכים למספר משפחות כימיות:
  • נגזרות קסנתין (אנ'): פלואורוסצאין (אנ'), רודמין (אנ'), אוריגון ירוק, אאוזין וטקסס אדום (אנ')
  • נגזרות ציאנין (אנ'): ציאנין (אנ'), אוקסקרבוציאנין, תיאקרבוציאנין, אינדוציאנין ירוק (ICG) (אנ') ומרוציאנין (אנ')
  • נגזרות נפתלן
  • נגזרות קומרין
  • נגזרות אוקסדיאזול (אנ'): ניתרובנזואקסדיאזול (אנ'), בנזואקסדיאזול (אנ') ופירידילוקסאזול
  • נגזרות אנטרסין (אנ')
  • נגזרות פירן (אנ')
  • נגזרות אוקסזין: נילוס אדום (אנ'), נילוס כחול (אנ') וקרסיל סגול (אנ')
  • נגזרות אקרידין (אנ'): פרופלבין (אנ'), אקרידין צהוב (אנ'), אקרידין כתום (אנ')
  • נגזרות אאורמין (אנ'): סגול גבישי, מלכיט ירוק (אנ')
  • נגזרות טטרפירול (אנ'): פורפין (אנ'), פאת'לוציאנין (אנ') ובילירובין
• קומפלקסי ליגנד-מתכתיים - כגון: רותניום דו פירידיני עם חומצה דיקרבוקסילית דו פירידינית ((Ru(bpy)2(dcbpy) (אנ'), טונגסטן עם פחמן חד-חמצני
• ננו-חלקיקים לומינסצנטיים (נקודות קוונטיות) - מחומרים כגון: קדמיום-סלניד (CdSe), קדמיום-טלור (CdTe), אבץ גופרתי (ZnS) וקדמיום גופרתי (CdS)
• חרוזים או פולימרים פלואורסצנטיים - מחומרים כגון: פוליסטירן, פוליאתילן, אקטין-F

פלואורופורים נפוצים

גרעיני ליקוציטים אנושיים מוכתמים על ידי הפלואורופור DAPI

צבעני תגובה וצימוד

פלואורסצנציה של חומרים שונים תחת תאורת UV. הירוק הוא פלואורוסצאין (אנ'), האדום הוא רודמין B (אנ'), הצהוב הוא רודמין 6G (אנ'), הכחול הוא כינין, והסגול הוא תערובת של כינין ורודמין 6G (אנ'). ריכוז החומרים בתמיסות (שרובן מים) המוצגות הוא כ-0.001 אחוז.

צבען	אורך גל בליעה מקסימלית (ננו-מטר)	אורך גל פליטה מקסימלית (ננו-מטר)	מסה מולרית
קומרין הידרוקסילי	325	386	331
אמינו קומרין	350	445	330
מתוקסי קומרין	360	410	317
NBD	466	539	294
R-PE (פיקוארתרין אדום)	480;565	578	240 אלף
חלבון כלורופיל פירידין	490	675	35KDa
פלואורוסצאין	495	519	389

צבעני חומצות גרעין

תאי אנדותל מוכתמים עם DAPI (כחול) ופלואידין (אנ') (אדום) ומקושרים דרך נוגדן לפלואורסצאין (אנ') (ירוק)

דגימת DNA מופרדת על ידי ג'ל אלקטרופורזה של חומצות גרעין ומוכתמת עם אתידיום ברומיד שפולט אור בצבע כתום אחרי קישורו עם ה-DNA.

צבען	אורך גל בליעה מקסימלית (ננו-מטר)	אורך גל פליטה מקסימלית (ננו-מטר)	מסה מולרית
Hoechst 33342	343	483	616
DAPI	345	455
Hoechst 33258	345	478	624
אתידיום ברומיד	493	620	394

חלבונים פלואורוסצנטיים

צבען	אורך גל בליעה מקסימלית (ננו-מטר)	אורך גל פליטה מקסימלית (ננו-מטר)	מסה מולרית	QY
GFP - מוטצית Y66H	360	442
GFP - מוטצית Y66F	360	508
BPE (כחול)	545	572	240KDa	0.98
RPE (אדום)	565 >498	573	250KDa	0.84

יישומים

לפלואורופורים יש חשיבות מיוחדת בתחומי הביוכימיה ומחקר החלבון, כמו גם באנליזה של התא (אימונוהיסטוכימיה) וחישה ביולוגית זעירה.^[3][7]

יישומים מחוץ לתחום מדעי החיים

• אבקות כביסה
• תעשיות הקוסמטיקה, ציוד הבטיחות והביגוד
• OLED
• עיצוב ואמנות
• הדברה
• תרופות ניסיוניות
• מרקרים
• פאנלים סולריים

ראו גם

• FRET
• חזרת הפלואורסצנציה לאחר הלבנתה

קישורים חיצוניים

• The Database of fluorescent dyes (אורכב 05.12.2012 ב Archive.today)
• Table of fluorochromes
• The Molecular Probes Handbook