Fragmento de Klenow

O fragmento de Klenow é un gran fragmento proteico con actividade encimática da ADN polimerase I da bacteria E. coli. Orixínase cando esta ADN polimerase I é clivada pola protease subtilisina, que elimina unha porción, e o que queda é o fragmento de Klenow. Obtívose en 1970 por H. Klenow et al.^[1] Con respecto ao encima completo, o fragmento de Klenow mantén a actividade de polimerase 5' → 3' e a de exonuclease 3’ → 5’ para eliminar nucleótidos precodificados e a corrección de probas, pero perdeu a actividade de exonuclease 5' → 3' que ademais tiña o encima completo.

Dominios funcionais do fragmento de Klenow (esquerda) e da ADN polimerase I (PDB).

O outro pequeno fragmento orixinado na clivaxe desta polimerase mantén a actividade de exonuclease 5' → 3', pero non ten as outras dúas actividades que presenta o fragmento de Klenow.

Investigación

Como a actividade exonuclease 5' → 3' da ADN polimerase I de E. coli fai que este encima sexa pouco axeitado para moitas aplicacións, o fragmento de Klenow, que non ten esa actividade, ten moitas aplicacións en investigación. O fragmento de Klenow é moi útil en tarefas de investigación que impliquen o seguinte:

• Síntese de ADN bicatenario a partir de moldes monocatenarios.
• Completar un extremo 3' que quedou máis curto dun fragmento de ADN para facer que o extremo 5' que sobresae quede igualado.
• Dixerir os extremos 3' que sobresaen.
• Preparar sondas de ADN radioactivas.

O fragmento de Klenow foi tamén o encima utilizado inicialmente para a amplificación de segmentos de ADN na reacción en cadea da polimerase (PCR),^[2] pero despois foi substituído nesta técnica por encimas termoestables como a Taq polimerase,^[3] que daban mellor resultado.

O fragmento de Klenow exo−

Igual que para certas tarefas a actividade exonuclease 5' → 3' da ADN polimerase I de E. coli era un inconveniente, para certas aplicacións tampouco é desexable a actividade de exonuclease 3' → 5' que mantén o fragmento de Klenow. Este problema pode solucionarse introducindo mutacións no xene que o codifica. Como resultado, exprésanse formas do encima que presentan a actividade de polimerase 5' → 3', pero que carecen de actividade de exonuclease, xa que o sitio activo correspondente se ve afectado. Esta forma do encima denomínase fragmento de Klenow exo- ou fragmento de Klenow exo menos.^[4]

O fragmento de Klenow exo- utilízase nalgunhas reaccións de marcaxe fluorescente para micromatrices, entre outras.