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La microscopie en fluorescence (ou en épifluorescence) est une technique utilisant un microscope optique en tirant profit du phénomène de fluorescence et de phosphorescence, au lieu de, ou en plus de l'observation classique par réflexion ou absorption de la lumière visible naturelle ou artificielle[1],[2].
On peut ainsi observer divers objets, substances (organiques ou inorganiques) ou échantillons d'organismes morts ou vivants.
Elle fait désormais partie des méthodes de recherche classiques et de la biologie et continue à se développer avec l'imagerie moléculaire.
La fluorescence est la propriété que possèdent certains corps d'émettre de la lumière après avoir absorbé des photons de plus haute énergie. La microscopie en fluorescence repose sur la formation d'une image par détection de cette lumière émise. Le déplacement de Stokes décrit la différence entre la longueur d'onde absorbée par l'objet (émise par la source lumineuse du microscope) et émise par l'objet. Plus la différence entre les deux longueurs d'onde est grande plus il est facile d'observer la fluorescence.
En fluorescence on distingue deux types d'objets :
En microscopie de fluorescence, on peut donc visualiser directement des substances fluorescentes. Pour des substances, des cellules, des molécules non fluorescentes, il est nécessaire de les marquer par des substances appelées fluorochromes, comme le DAPI qui marque l'ADN et fluoresce en bleu.
Certains marqueurs génétiques comme la protéine fluorescente verte, (en anglais Green Fluorescent Protein ou GFP) sont aussi très utilisés en biologie dans des organismes génétiquement modifiés pour en produire de manière endogène. Dans ce cas, le fluorochrome est une protéine produite directement par la cellule elle-même et ne nécessite pas l'ajout de substrat. La fluorescence peut alors être visualisée directement dans les cellules vivantes, c'est un des domaines développés par l'imagerie moléculaire.
De nombreuses techniques de marquage peuvent être utilisées :
On peut exciter les substances fluorescentes par une excitation monophotonique. On utilise pour cela une lumière d'excitation dont la longueur d'onde excite directement le fluorophore. Donc, la fluorescence émise peut provenir de toute l'épaisseur de l'échantillon traversée par le faisceau d'excitation. L'élément clé de ce microscope confocal est alors représenté par une « fenêtre » (un sténopé ou un iris confocal) placée devant le détecteur qui élimine la fluorescence provenant des régions non focales. L'observation de signaux de fluorescences repose sur cinq éléments :
Cette excitation consiste en l'absorption quasi simultanée de plusieurs photons d'excitation d'une longueur d'onde proche d'un multiple de l'excitation optimale à un photon. On utilise pour cela un laser pulsé dans des fréquences proches de l'infrarouge. Dans ce cas, seul le point de focalisation du faisceau laser est excitateur (densité de photon suffisante pour coupler l'énergie d'excitation). Bien souvent les applications sont limitées à la microscopie biphotonique (excitation du fluorophore par deux photons).
Ce système est considéré comme une évolution technologique importante pour trois raisons majeures :
En pratique, le rendement d'émission de fluorescence est moins bon qu'un confocal simple photon et le rapport signal/bruit est plus faible. Ainsi, il ne montre que peu d'avantage pour l'observation de cellules en culture ou de coupes de tissu (50-70 µm d'épaisseur).
Cette technique est naturellement utilisée pour l'excitation simultanée de plusieurs fluorophores à spectres d'émission différents.
Une variante de cette technique est la « microscopie à fluorescence par excitation multiphotonique multifocale ». Le principe est identique, mais le faisceau laser est divisé en plusieurs faisceaux ce qui permet de balayer simultanément plusieurs points. Ceci permet de diminuer le temps d’acquisition des images.
Les techniques de fluorescence peuvent être utilisées avec différents types de microscope :
Ces appareils possèdent des pièces interchangeables en forme de cube disposées sur une tourelle rotative ou sur une tirette selon les fabricants.
Ces « cubes » filtrent la lumière allant vers l'objectif et allant vers l'observateur ou le capteur, selon les fluorescences recherchées.
Ils comportent deux filtres et un miroir particulier, « dichroïque » qui réfléchit certaines longueurs d'onde et qui est traversé par d'autres.
Vers la source se trouve le filtre d'excitation.
Côté observateur se trouve le filtre barrière.
Les cubes sont répertoriés selon les lumières d'excitation: ultraviolet, violet, bleu, vert[4]...
On utilise cette technique, notamment pour observer des monocouches lipidiques auxquelles on a ajouté une sonde lipidique fluorescente. On observe une fluorescence selon la phase dans laquelle se trouve le lipide principal. En général, la sonde est soluble dans la phase liquide-expansé (LE) mais pas dans les phases gazeuse (G) ou solide (S). Ceci permet d'observer les macrostructures formées par la monocouche. Ci-contre, on observe une monocouche lipidique à l'équilibre par microscopie à épifluorescence. La sonde fluorescente lipidique est soluble dans la phase LE mais pas dans la phase G. Le résultat est qu'on observe, à l'équilibre, des sortes de bulles (mais une « bulle » est un concept tridimensionnel) dont les parois sont constituées du lipide en phase LE et l'intérieur en phase G. Si l'on prend un exemple tridimensionnel, cela reviendrait à prendre de la mousse de savon et à en couper une très fine tranche.
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