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L'électrophorèse sur gel d'agarose est une méthode utilisée en biochimie et en biologie moléculaire pour séparer l'ADN, l'ARN ou des protéines en fonction de leur masse moléculaire.
La technique de l'électrophorèse sur gel d'agarose est basée sur la séparation des acides nucléiques chargés négativement sous l'effet d'un champ électrique. Cette séparation s'effectue à travers la matrice du gel d'agarose : les molécules de plus petites tailles se déplacent plus rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures[1].
Les avantages de l'électrophorèse sur gel d'agarose sont les suivants :
Le facteur le plus important est la longueur de la molécule d'ADN : la séparation se fait en fonction de la masse moléculaire et donc de la taille de l'ADN. Toutefois la conformation de l'ADN est aussi un facteur important. Ainsi pour éviter les problèmes liés à cette conformation, n'est séparé sur gel d'agarose uniquement que de l'ADN linéaire (fragment d'ADN issu d'une digestion, ADN amplifié par PCR ou encore de l'ADNc).
L'augmentation de la concentration d'agarose dans un gel réduit la vitesse de migration et permet la séparation de fragment d'ADN de plus petite taille. Plus le voltage est important, plus la vitesse de migration augmente. Toutefois le voltage est limité en intensité, effectivement un fort voltage induit une augmentation de température ce qui peut faire fondre le gel.
La conformation d'ADN plasmidique, non digéré par une enzyme de restriction, migre à différentes vitesses (du plus lent au plus rapide) : ADN circulaire, ADN linéaire et ADN superenroulé.
On utilise généralement un gel 1 % m/V (1 g d'agarose pour 100 ml de volume final) en électrophorèse. Plus on veut un gel discriminant, plus on augmentera le pourcentage d'agarose.
L’agarose est un polymère à base d'agar purifié. Différentes puretés d'agarose sont disponibles auprès des fournisseurs. En général, de l'agarose de grande pureté à la solidification lente est utilisé lorsque l'ADN doit être extrait du gel après migration.
Il existe un nombre très varié de tampons. Les plus souvent utilisés sont le Tris/Acétate/EDTA (TAE), le Tris/Borate/EDTA (TBE) et le sodium borate (SB).
Le TAE possède le plus faible pouvoir tampon mais produit une meilleure séparation pour les fragments d'ADN de grande taille.
Le SB est relativement nouveau et inefficace pour la séparation de fragments d'ADN d'une taille supérieure à 5000 paires de bases (5 kb). Cependant sa faible conductivité permet l'utilisation d'un plus fort voltage (jusqu'à 35V/cm), ceci réduisant considérablement le temps de migration.
Des fragments d'ADN avec seulement quelques paires de bases de différences sont séparés en utilisant un gel d'agarose à 3 % et avec un tampon SB de très faible conductivité (1 mM lithium borate)[2].
Exemple pour un mini-gel de 50 ml destiné à séparer des fragments de 2 à 6 kb
Afin de visualiser la migration de l’électrophorèse, il faut préalablement ajouter un colorant dans le gel à une concentration prescrit par le fabricant de l’agent intercalant ou encore procéder à une révélation post-migration. La méthode de révélation la plus utilisée est la révélation au bromure d'éthidium ou BET. Le bromure d'éthidium est un agent d'intercalation couramment utilisé comme marqueur d'acide nucléique dans les laboratoires de biologie moléculaire. Lorsqu'il est exposé à des rayonnements ultraviolets, il devient fluorescent avec une couleur rouge-orangée, 20 fois plus intense lorsqu'il est lié à l'ADN. Cet effet serait dû à l'augmentation de l'hydrophobie de l'environnement, plutôt qu'à une rigidification du cycle benzénique, celui-ci n'étant pas situé entre les paires de bases. Cependant, le bromure d’éthidium est toxique et hautement mutagène et doit être manipulé avec grande précaution. D’autres agents intercalants plus sécuritaires comme le GelRed, le SYBR Safe, le violet de gentiane et le bleu de méthylène peuvent être utilisés[3].
C'est un produit classé CMR (cancérogène, mutagène et reprotoxique). Le GelRed est un colorant fluorescent utilisé pour la révélation sur gels d’agarose ou de polyacrylamide d’ADNdb, d’ADNsb ou d’ARN. Il possède pour caractéristiques d’être hautement spécifique, très stable. De plus, sa sensibilité est supérieure au bromure d’éthidium et il ne requiert pas d’étapes de décoloration[4].
1. Ajouter le GelRed à l’agarose fondu pour une concentration finale de 1X.
2. Couler le gel et procéder à la migration.
3. Visualiser la migration avec un appareil UV[5].
Le SYBR Safe est un colorant à gel d’agarose ou de polyacrylamide possédant une haute sensibilité. Il agit comme agent intercalant pour l’ADN ainsi que l’ARN. Le fabricant vend le produit à une concentration déjà prête pour l’usage. La visualisation de la migration peut être faite en excitant l’agent avec des rayons UV ou encore avec de la lumière bleue[6].
Il est possible d’utiliser le violet de gentiane comme agent de visualisation pour un électrophorèse sur gel d’agarose. Il est nécessaire d’avoir une grande concentration d’ADN(100 ng et plus) à faire migrer étant donné la faible sensibilité de cette méthode. Comparativement au bromure d’éthidium, ce colorant doit être ajouté à une concentration de 10 ug/ml dans le gel ainsi que dans le tampon de migration pour obtenir des résultats adéquats. Afin d’augmenter la sensibilité de la méthode, il est d’abord possible de décolorer le gel dans l’eau une fois la migration terminée. Ensuite, il est recommandé d’effectuer une seconde coloration dans un grand volume de tampon TAE 0,1X contenant 10ug/ml de violet de gentiane à la fin de la migration[7].
Le Bleu de méthylène peut être utilisé comme révélateur à la fin de la migration sur gel d’agarose ou de polyacrylamide. Cette méthode nécessite un temps de coloration pouvant aller jusqu’à 15 heures étant donné sa faible sensibilité. Son avantage est simplement qu’il permet de ne pas utiliser le bromure d’éthidium et que sa décoloration nécessite seulement de l’eau distillé. Toutefois, l’utilisation de ce colorant induit une coloration de fond difficile à éliminer et cela rend la visualisation des bandes plus difficile[8].
Alternativement, le gel peut être incubé dans un bain contenant du SYBR Green I (pour les acides nucléiques doubles brins) ou du SYBR Green II (pour détecter aussi les acides nucléiques simples brins). Le SYBR Green présente l'avantage d'une moindre toxicité et d'une sensibilité plus élevée permettant de détecter des quantités plus faibles d'acides nucléiques.
L'électrophorèse sur gel d'agarose permet théoriquement la séparation de fragments d'ADN d'une taille allant de 50 paires de bases à plusieurs millions. Cependant, elle est généralement utilisée pour la séparation de fragment d'une taille allant de 100 pb à 20 kpb. La durée moyenne de migration est d'une heure.
Les petits fragments d'acides nucléiques sont mieux séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les fragments de tailles importantes sont plus difficiles à séparer. En général, l'utilisation de gel d'agarose à forte concentration (3 à 4 %) est alors nécessaire pour des fragments inférieurs à 150 pb, car elle permet une meilleure séparation et résolution des différentes bandes en fonction de leur différence de taille. Le principal désavantage est le temps de migration, qui peut aller jusqu'à plusieurs jours. Pour pallier ces problèmes, il est avantageux d'effectuer une électrophorèse en champ pulsé ou bien une électrophorèse en champ inversé.
Après la migration d'électrophorèse, le gel est éclairé sous ultraviolet afin d'observer les bandes d'ADN fluorescente. Les bandes peuvent être alors découpées et séparées du gel, puis dissoutes afin de récupérer l'ADN purifié. L'estimation de la taille des fragments est faite grâce à la comparaison avec l'échelle de marqueur de taille moléculaire (DNA-ladder) utilisée simultanément dans un autre puits lors de la migration.
Le gel est généralement pris en photo avec un appareil photo numérique. Bien que la couleur de l'ADN fluorescent soit rouge-orangée, les photographies sont publiées en noir et blanc (voir schéma ci-dessous).
Les gels d'électrophorèse utilisés en vue de publications sont le plus souvent analysés en utilisant des logiciels informatiques, comme ImageJ.
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