Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας
Η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) είναι μια τεχνική χρωματογραφίας που χρησιμοποιείται στον διαχωρισμό μη πτητικών μειγμάτων. From Wikipedia, the free encyclopedia
Η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) είναι μια τεχνική χρωματογραφίας που χρησιμοποιείται στον διαχωρισμό μη πτητικών μειγμάτων. From Wikipedia, the free encyclopedia
Η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (ΧΛΣ) (αγγλ.: thin-layer chromatography ή TLC) είναι η τεχνική χρωματογραφίας που χρησιμοποιείται στον διαχωρισμό μη πτητικών μειγμάτων.[1] Η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας εκτελείται σε μια πλάκα από γυαλί, πλαστικό, ή φύλλο αργιλίου, που επικαλύπτεται με μια λεπτή στρώση από προσροφητικό υλικό, συνήθως διοξειδίου του πυριτίου, οξειδίου του αργιλίου, ή κυτταρίνης. Αυτή η στρώση προσροφητή είναι γνωστή ως στατική φάση (αγγλ.: stationary phase).
Αφού το δείγμα έχει εφαρμοστεί στην πλάκα, ένας διαλύτης ή μείγμα διαλυτών (γνωστό ως η κινητή φάση (αγγλ.: mobile phase)) ανέρχεται στην πλάκα μέσω τριχοειδούς κίνησης. Επειδή διαφορετικές αναλυόμενες ουσίες ανεβαίνουν τον δίσκο TLC με διαφορετικούς ρυθμούς, επιτυγχάνεται διαχωρισμός.[2]
Η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση της προόδου μιας αντίδρασης, την ταυτοποίηση των υφιστάμενων ενώσεων σε ένα δεδομένο μείγμα και τον καθορισμό της καθαρότητας μιας ουσίας. Ειδικά παραδείγματα αυτών των εφαρμογών περιλαμβάνουν: την ανάλυση κεραμιδίων (ceramides) και λιπαρών οξέων, την ανίχνευση παρασιτοκτόνων ή εντομοκτόνων στην τροφή και το νερό, την ανάλυση της σύστασης χρωστικών ινών στην εγκληματολογία, τον προσδιορισμό της ραδιοχημικής καθαρότητας των ραδιοφαρμάκων, ή ταυτοποίηση φαρμακευτικών φυτών και των συστατικών τους [3]
Ένας αριθμός βελτιώσεων μπορεί να γίνει στην αρχική μέθοδο για την αυτοματοποίηση των διαφόρων σταδίων, την αύξηση της επιτυγχανόμενης ανάλυσης με TLC και τη δυνατότητα πιο ακριβούς ποσοτικής ανάλυσης. Αυτή η μέθοδος αναφέρεται ως «χρωματογραφία λεπτής στιβάδας υψηλής απόδοσης» (αγγλ.: high-performance TLC ή HPTLC).
Οι πλάκες TLC είναι συνήθως εμπορικά διαθέσιμες, με τυπικές περιοχές μεγέθους σωματιδίων για βελτίωση της αναπαραγωγιμότητας. Προετοιμάζονται με την ανάμειξη του προσροφητή, όπως το διοξείδιο του πυριτίου (silica gel), με μικρή ποσότητα αδρανούς συνδετικού υλικού όπως θειικού ασβεστίου (γύψου) και νερού. Αυτό το μείγμα απλώνεται ως παχύς πολτός σε ένα μη δραστικό φορέα χαρτιού, συνήθως γυαλί, παχύ φύλλο αργιλίου, ή πλαστικό. Η τελική πλάκα ξηραίνεται και ενεργοποιείται με θέρμανση σε έναν φούρνο για τριάντα λεπτά στους 110 °C. Το πάχος της απορροφητικής στιβάδας είναι τυπικά περίπου 0,1 – 0,25 mm για αναλυτικούς σκοπούς και περίπου 0,5 – 2,0 mm για προπαρασκευαστική TLC.[4]
Η διεργασία είναι παρόμοια με τη χρωματογραφία χάρτου με το πλεονέκτημα ταχύτερων διαδικασιών, καλύτερων διαχωρισμών και την επιλογή μεταξύ μεταξύ διαφορετικών στατικών φάσεων. Λόγω της απλότητας και της ταχύτητάς της η TLC χρησιμοποιείται συχνά για παρακολούθηση χημικών αντιδράσεων και για την ποιοτική ανάλυση των προϊόντων της αντίδρασης.
Για την εκτέλεση μιας χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας, επιτελείται η παρακάτω διεργασία:[5]
Διαφορετικές ενώσεις στο μείγμα του δείγματος κινούνται με διαφορετικές ταχύτητες λόγω των διαφορών στην έλξη τους με την στατική φάση και λόγω των διαφορών στη διαλυτότητα στον διαλύτη.[6] Αλλάζοντας τον διαλύτη, ή χρησιμοποιώντας ίσως ένα μείγμα, μπορεί να ρυθμιστεί ο διαχωρισμός των συστατικών (μετρούμενος από την τιμή του χρόνου καθυστέρησης (Retardation factor ή Rf)). Επίσης, ο διαχωρισμός που επιτυγχάνεται με μια πλάκα TLC μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση του διαχωρισμού μιας στήλης.[7]
Ο διαχωρισμός των ενώσεων βασίζεται στον ανταγωνισμό της διαλυμένης ουσίας και της κινητής φάσης για σύνδεση σε θέσεις της στατικής φάσης.[3] Παραδείγματος χάρη, αν η κανονική φάση οξειδίου του πυριτίου χρησιμοποιείται ως η στατική φάση, μπορεί να θεωρηθεί ως πολική. Με δεδομένες δύο ενώσεις που διαφέρουν σε πολικότητα, η πιο πολική ένωση έχει μια ισχυρότερη αλληλεπίδραση με το οξείδιο του πυριτίου και είναι, συνεπώς, πιο ικανή στην απομάκρυνση της κινητής φάσης από τα σημεία σύνδεσης. Ως συνέπεια, η λιγότερο πολική ένωση μετακινείται πιο ψηλά στην πλάκα (με αποτέλεσμα μια μεγαλύτερη τιμή Rf).[6] Εάν η κινητή φάση μεταβλήθηκε σε έναν πιο πολικό διαλύτη ή μείγμα διαλυτών, θα μπορεί να απομακρύνει καλύτερα τις διαλυμένες ουσίες από τις θέσεις σύνδεσης του διοξειδίου του πυριτίου και όλες οι ενώσεις στην πλάκα TLC θα μετακινηθούν υψηλότερα στον δίσκο. Λέγεται συχνά ότι οι "ισχυροί" διαλύτες (μέσα έκλουσης) ωθούν τις αναλυόμενες ενώσεις προς τα πάνω στην πλάκα ενώ τα "ασθενή" μέσα έκλουσης μόλις τις μετακινούν. Η σειρά ισχύος εξαρτάται από την επικάλυψη (στατική φάση) της πλάκας TLC. Για πλάκες TLC καλυμμένους με διοξείδιο του πυριτίου, η ισχύς του μέσου έκλουσης αυξάνει με την ακόλουθη σειρά: υπερφθοροαλκάνιο (perfluoroalkane) (το πιο ασθενές), εξάνιο, πεντάνιο, τετραχλωράνθρακας, βενζόλιο/τολουόλιο, διχλωρομεθάνιο, διαιθυλαιθέρας, αιθανικός αιθυλεστέρας, αιθανονιτρίλιο, προπανόνη, 2-προπανόλη/1-βουτανόλη, νερό, μεθανόλη, τριαιθυλαμίνη, αιθανικό οξύ, μεθανικό οξύ (το πιο ισχυρό). Για πλάκες επικαλυμμένες με C18 η σειρά είναι η αντίστροφη. Αυτό σημαίνει ότι αν χρησιμοποιείται ένα μείγμα από οξικό αιθύλιο και εξάνιο ως κινητή φάση, η προσθήκη περισσότερου οξικού αιθυλίου καταλήγει σε υψηλότερες τιμές Rf για όλες τις ενώσεις στην πλάκα TLC. Η αλλαγή της πολικότητας της κινητής φάσης, κανονικά, δεν θα καταλήξει σε αντίστροφη σειρά εμφάνισης των ενώσεων στην πλάκα TLC. Μια σειρά έκλουσης (eluotropic series) μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως οδηγός στην επιλογή κινητής φάσης. Αν είναι επιθυμητή η αντίστροφη σειρά εμφάνισης των ενώσεων, θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί μια απολική στατική φάση, όπως λειτουργικό διοξείδιο του πυριτίου C-18 (C18-functionalized silica).
Καθώς οι ενώσεις διαχωρίζονται μπορεί να είναι άχρωμες και υπάρχουν αρκετές μέθοδοι για οπτικοποίηση των κηλίδων:
Μόλις γίνουν ορατές οι κηλίδες, η τιμή Rf (συντελεστής επιβράδυνσης) κάθε κηλίδας μπορεί να προσδιοριστεί διαιρώντας την απόσταση που διάνυσε το προϊόν με την απόσταση που διάνυσε το μέτωπο του διαλύτη χρησιμοποιώντας την αρχική θέση κηλίδωση ως αναφορά. Αυτές οι τιμές εξαρτώνται από τον χρησιμοποιούμενο διαλύτη και τον τύπο της πλάκας TLC και δεν είναι φυσικές σταθερές.
Στην οργανική χημεία, οι αντιδράσεις παρακολουθούνται ποιοτικά με TLC. Κηλίδες των οποίων ελήφθησαν δείγματα με τριχοειδή σωλήνα τοποθετούνται στην πλάκα: μια κηλίδα του αρχικού υλικού, μια κηλίδα από το μείγμα της αντίδρασης και μια ενδιάμεση και με τα δύο. Μια μικρή πλάκα (3 επί 7 cm) TLC χρησιμοποιείται για την εκτέλεση της χρωματογραφίας και παίρνει λίγα λεπτά. Η ανάλυση είναι ποιοτική και η αντίδραση θα ολοκληρωθεί όταν το αρχικό υλικό έχει εξαφανιστεί και παρατηρείται αν έχει εμφανιστεί κάποιο προϊόν και πόσα προϊόντα έχουν δημιουργηθεί (αν και αυτό μπορεί να υπεκτιμηθεί λόγω της συνέκλουσης). Δυστυχώς, οι TLCs από αντιδράσεις χαμηλής θερμοκρασίας μπορεί να δώσουν παραπλανητικά αποτελέσματα, επειδή το δείγμα θερμαίνεται σε θερμοκρασία δωματίου στον τριχοειδή, που μπορεί να μεταβάλει την αντίδραση—το δείγμα που θερμάνθηκε και αναλύθηκε από TLC δεν είναι το ίδιο με αυτό της χαμηλής θερμοκρασίας. Μια τέτοια αντίδραση είναι η αναγωγή του DIBALH του εστέρα σε αλδεΰδη.
Σε μια μελέτη εφαρμόστηκε TLC στην ανίχνευση των οργανικών αντιδράσεων,[11] παραδείγματος χάρη στην σύνθεση του BINAP από 2-ναφθόλη. Σε αυτήν τη μέθοδο, το διάλυμα αλκοόλης και καταλύτη (π.χ. χλωριούχος σίδηρος(III)) τοποθετήθηκαν ξεχωριστά στη γραμμή βάσης, έπειτα αντέδρασαν και κατόπιν αναλύθηκαν άμεσα.
Επειδή διαφορετικές ενώσεις θα διανύσουν μια διαφορετική απόσταση στη στατική φάση, η χρωματογραφία μπορεί στην πραγματικότητα να χρησιμοποιηθεί ως μια τεχνική απομόνωσης. Επειδή κάθε διαχωριζόμενη ένωση καταλαμβάνει μια διαφορετική περιοχή στον δίσκο, μπορεί να απομακρυνθεί, να τοποθετηθεί σε έναν άλλο διαλύτη για να διαχωριστεί από τη στατική φάση και να χρησιμοποιηθεί για παραπέρα ανάλυση. Παραδείγματος χάρη, στη χρωματογραφία ενός εκχυλίσματος πράσινων φύλλων (π.χ. σπανάκι) σε 7 στάδια ανάπτυξης, το καροτένιο εκλούεται γρήγορα και είναι ορατό μόνο μέχρι το δεύτερο στάδιο. Η χλωροφύλλη A και B είναι στη μέση του τελικού σταδίου και η λουτεΐνη η πρώτη ένωση που βάφεται κίτρινη. Μόλις τελειώσει η χρωματογραφία, το καροτένιο μπορεί να αφαιρεθεί από την πλάκα, να επανατοποθετηθεί σε έναν διαλύτη και να εξετασθεί σε ένα φασματοφωτόμετρο για να μετρηθεί το μήκος κύματος της απορρόφησης.
