Digital Polymerase Chain Reaction
biochemische Methode zur Mengenbestimmung Aus Wikipedia, der freien Enzyklopädie
Die Digital Polymerase Chain Reaction (zu deutsch ‚Digitale Polymerase-Kettenreaktion‘, auch dPCR, digital PCR, Digital-PCR) ist eine biochemische Methode zur Mengenbestimmung einzelner DNA-Sequenzen.[1] Sie ist eine Variante der Polymerase-Kettenreaktion.
Prinzip
Die dPCR verwendet im Gegensatz zur PCR eine Vereinzelung der DNA-Moleküle durch Grenzverdünnung und Mikrofluidik in einer großen Anzahl getrennter Reaktionsgefäße mit einem Volumen im Femtoliterbereich (z. B. 36 fL).[2][3] Dadurch werden im Unterschied zur Mengenbestimmung per qPCR Varianzen der Amplifikationseffizienz vermieden, bei geringerer Empfindlichkeit gegenüber PCR-Inhibitoren, aber höherer Nachweisgrenze.[4] Die Verteilung der DNA-Moleküle folgt der Poisson-Verteilung.
Die Amplifikation mit der DNA-Polymerase erfolgt mit den vereinzelten DNA-Molekülen. Daher kommt es in jedem Reaktionsgefäß zu einem digitalen Ergebnis (Amplifikation: ja oder nein), woher die Bezeichnung stammt. Durch Auszählen einer großen Anzahl von Reaktionsgefäßen (High-throughput screening mit circa 20.000 Reaktionsgefäßen auf einem Quadratmillimeter)[2] wird eine statistische Signifikanz erreicht. Der Anteil an Reaktionsgefäßen mit erfolgter Amplifikation ist proportional zur eingesetzten DNA-Menge der amplifizierten DNA-Sequenz, was zur Mengenbestimmung verwendet wird. Die dPCR kann auch mit Varianten der isothermalen DNA-Amplifikation kombiniert werden.[4]
Anwendungen
Die dPCR wird unter anderem zur Diagnostik von Pathogenen,[5] zur Bestimmung selten vorkommender DNA-Sequenzen und Gene copy number variants,[6] selten vorkommender Mutationen[7] (Primer-bindende Varianten unter 1 %)[8] und zu Mengenvergleichen bei der Genexpression verwendet.[9]
Geschichte
Die dPCR wurde 1992 von Alec A. Morley und Pamela J. Sykes entwickelt.[1]
Literatur
- B. K. Jacobs, E. Goetghebeur, L. Clement: Impact of variance components on reliability of absolute quantification using digital PCR. In: BMC Bioinformatics. Band 15, 2014, S. 283, doi:10.1186/1471-2105-15-283, PMID 25147026.
Einzelnachweise
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