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molekularbiologische Methode zum Nachweis von Nukleinsäuren Aus Wikipedia, der freien Enzyklopädie
In-situ-Hybridisierung (ISH, auch Hybridisierung in situ) ist eine molekularbiologische Methode zum Nachweis von Nukleinsäuren (RNA oder DNA) in Geweben, einzelnen Zellen oder auf Metaphase-Chromosomen. Dabei wird eine künstlich hergestellte Sonde aus einer Nukleinsäure eingesetzt, die über Basenpaarungen an die nachzuweisende Nukleinsäure bindet (Hybridisierung).
Weite Verbreitung haben die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) für den Nachweis von DNA oder RNA (RNA-FISH) in Zellkernen, bzw. dem Cytoplasma einzelner Zellen oder auf Metaphase-Chromosomen sowie die Untersuchung der Verteilung von mRNA in ganzen Embryonen, Schnitten oder Geweben mit farbgebenden (chromogenen) Molekülen.
Weitere verwendete Bezeichnungen sind genomische In-situ-Hybridisierung (GISH), bei der als Sonde gesamtgenomische DNA eingesetzt wird, sowie chromosomale In-situ-Suppressionshybridisierung (CISS-Hybridisierung), mit der die Markierung von ganzen Chromosomen möglich ist.
In-situ-Hybridisierung wurde Ende der 1960er Jahre von den US-amerikanischen Biologen Mary-Lou Pardue und Joseph G. Gall entwickelt.[1][2] Sie verwendeten radioaktiv markierte Sonden (Isotopenmarkierung), die Präparate mussten anschließend auf einen Röntgenfilm gelegt werden und wurden zur besseren Auflösung mittels Mikroskop mit einer Fotoemulsion versehen. Neben den allgemeinen mit Radioaktivität verbundenen Problemen war die räumliche Auflösung dabei verglichen mit heutigen Techniken schlecht. Daher setzten sich später Sonden durch, die kovalent an die Markierungsmoleküle gebunden waren (siehe unten).
Die In-situ-Hybridisierung beruht auf der Paarung von komplementären Basen auf zwei Nukleinsäure-Einzelsträngen. Einer der beiden Stränge kommt dabei von einer zuvor hergestellten und markierten Sonde, der andere liegt im Präparat vor und soll nachgewiesen werden. Die ersten Arbeitsschritte sind demnach Vorbereitung des Präparats sowie Vorbereitung der Sonde. Die Sonde besteht häufig aus DNA, da diese stabiler ist als RNA und somit im Labor einfacher zu handhaben ist. Auch lässt sich DNA mit heutigen Verfahren einfacher vermehren. Bei der RNA In-situ-Hybridisierung hat sich die Verwendung von Riboproben durchgesetzt, da sich sense- und antisense-Proben mit hoher Spezifität mittels In-Vitro-Transkription herstellen lassen. Ein Vorteil ist auch, dass sich nicht hybridisierte RNA mittels RNase abbauen lässt. Die Markierung der Sonde kann indirekt mit Haptenen (z. B. Digoxigenin, Biotin oder 2,4-Dinitrophenol) oder bei der FISH auch direkt mit fluoreszierenden Molekülen wie FITC oder Cy3 erfolgen. Häufig eingesetzte Verfahren zur Markierung der Sonden sind Nick-Translation, PCR und In-vitro-Transkription.
Da DNA normalerweise als Doppelstrang vorliegt, muss dieser zuvor getrennt (auch: aufgeschmolzen oder denaturiert) werden. Eine Denaturierung kann entweder durch Verschiebung des pH-Werts (sowohl sauer als auch alkalisch) oder durch Hitze erfolgen. Bei einer Hitzedenaturierung wird der Schmelzpunkt meist durch Zugabe von Formamid abgesenkt, welches durch seine starke Polarität die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den DNA-Einzelsträngen abschwächt. Dadurch kann ein Aufschmelzen bereits bei Temperaturen um 70–75 °C erreicht werden, wodurch die Struktur der Chromosomen weniger stark zerstört wird. Weiterhin kann die DNA auch durch ein Molecular Combing gestreckt und ausgerichtet werden.
Die eigentliche Hybridisierung dauert, je nach Sondenmaterial und Zielsequenz, zwischen einer Stunde und mehreren Tagen. Anschließend liegen im Präparat Hybridmoleküle aus den Nukleinsäuren des Präparats und der Sonde vor. Nicht oder unspezifisch gebundene Sondenmoleküle werden herausgewaschen und gebundene Sondenmoleküle können nachgewiesen werden. Bei der indirekten Markierung geschieht dies über eine Antikörperfärbung oder im Fall von Biotin mit Avidin. Die Antikörper (oder das Avidin) sind wiederum an Fluorophore (bei der FISH) oder an Enzyme gebunden, welche aus zuzugebenden chromogenen Substraten Farbstoffe bilden. Beides wird anschließend mikroskopisch ausgewertet.
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Bei dieser Anwendung findet vor allem Digoxigenin-markierte RNA Verwendung. Das Digoxigenin kann mit Hilfe eines Antikörpers, der beispielsweise mit einem Enzym gekoppelt ist, erkannt werden. Das Enzym, meistens Alkalische Phosphatase oder Peroxidase, kann dann durch Zusatz von Reagenzien einen Farbstoff umsetzen, der kovalent im Gewebe gebunden bleibt und sich daher nicht durch Diffusion verteilt. Beim Nachweis von mRNA in Geweben werden nur jene Zellen angefärbt (hybridisiert), in denen ein zu untersuchendes Gen aktiv ist: Nur hier liegt die entsprechende mRNA vor. Dieses Verfahren findet besonders in der Entwicklungsbiologie Anwendung. Hier ist es von besonderem Interesse, die Aktivität eines Gens beispielsweise während der Embryogenese in situ zu verfolgen. Das embryonale oder auch adulte Gewebe muss für die Färbung zunächst fixiert werden; die Aktivität kann daher nicht in Echtzeit verfolgt werden, sondern ist nur eine Momentaufnahme des Zustands, in dem sich das Gewebe befand, als es fixiert wurde.
Das zu färbende Gewebe – beispielsweise Embryonen von verschiedenen Modellorganismen wie Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Xenopus laevis, Mus musculus, Danio rerio – wird mit Hilfe von formaldehydhaltigen Lösungen fixiert. Anschließend wird es in einen formamidhaltigen Puffer überführt und die markierte Sonde dazugegeben. Die Hybridisierungszeit hängt von der Größe des Embryos ab und dauert mindestens einige Stunden. In dieser Zeit kann die Sonde durch das Gewebe diffundieren und bindet überall dort, wo sich komplementäre Sequenzen in der mRNA finden. Es folgen einige Waschschritte, in denen überschüssige, nicht gebundene Sonden ausgewaschen werden, und am Schluss die Färbung, die dann mit einem Mikroskop genau analysiert und dokumentiert werden kann.
Neben Totalpräparaten, beispielsweise von Fliegenembryonen (linke Abbildung), kann die In-situ-Hybridisierung an Gewebe-Dünnschnitten durchgeführt werden. Auf diese Weise können auch größere Präparate wie menschliches Gewebe oder komplette Mausembryonen untersucht werden (rechte Abbildung).
Bei der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) wird die Sonde mit Hilfe eines fluoreszierenden Farbstoffes nachgewiesen. Dies ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Strukturen durch den Einsatz verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe, zum Beispiel den Nachweis eines Chromosoms mit zwei darauf liegenden Genen. Auf Chromosomenpräparaten und auf Zellkernen konnten bereits bis zu sieben verschiedene Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden.[3]
Die Möglichkeit, das Vorhandensein bzw. die Anzahl von Teilen des Genoms vergleichsweise einfach im Fluoreszenzmikroskop zu bestimmen, wird für die klinische Diagnostik in verschiedenen Disziplinen benutzt.
Für den Nachweis von Erbkrankheiten werden in der Regel Präparate von Chromosomen in der Metaphase eingesetzt, die aus im Labor vermehrten Zellen von Patienten oder, bei der Pränataldiagnostik, aus Zellen des ungeborenen Kindes hergestellt wurden (siehe auch FISH-Test). Auf diese werden dann beispielsweise Sonden für das Chromosom 21 hybridisiert, um zu testen, ob es drei- statt zweimal vorhanden ist und somit die Ursache für das Down-Syndrom vorliegt. Ob bestimmte chromosomale Regionen fehlen, wie etwa beim Katzenschrei-Syndrom, lässt sich mit Sonden für solche Regionen ebenfalls feststellen. Prinzipiell lassen sich solche Untersuchungen auch an Zellkernen durchführen, also ohne dass Metaphasepräparate hergestellt werden müssen. Dies hat jedoch den Nachteil, dass nicht jeder Kern ein richtiges Ergebnis liefert: Wenn zwei nachzuweisende Chromosomen im Kern zufällig nebeneinander liegen, dann lassen sich beide nicht als zwei Signale erkennen. Es müssen daher viele Kerne ausgezählt werden und ein Vergleich mit bekanntermaßen normalen Kernen muss durchgeführt werden, um eine sichere Aussage treffen zu können. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt in der höheren Geschwindigkeit, da eine Vermehrung der Zellen im Labor nicht oder nur in geringerem Umfang nötig ist. Auch bei der Charakterisierung von Markerchromosomen wird FISH eingesetzt.[4]
Bei der Untersuchung des Genoms von Tumor-Zellen wird FISH eingesetzt, um Chromosomenaberrationen festzustellen. Beispielsweise können Metaphasepräparate mit FISH untersucht werden, um chromosomale Umbauten zu erkennen, die sich durch G-Bänderung nicht diagnostizieren lassen. Hierfür können Sonden für verschiedene menschliche Chromosomen der Reihe nach ausprobiert werden. Vielfarben-FISH erlaubt es auch, sämtliche Chromosomen in unterschiedlichen Farbkombinationen nachzuweisen, so dass sämtliche Umbauten zwischen verschiedenen Chromosomen in einem Experiment erkannt werden können.[5][6] Die hierfür erforderlichen Methoden sind jedoch anspruchsvoll und erfordern eine spezielle mikroskopische Ausstattung. Manche chromosomale Umbauten treten bei bestimmten Tumorarten gehäuft auf, beispielsweise das Philadelphia-Chromosom bei manchen Leukämien. Bei Non-Hodgkin-Lymphomen haben verschiedene Untergruppen unterschiedliche typische genetische Veränderungen. Das Vorhandensein solcher Veränderungen kann mit FISH gezielt getestet werden.
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