propojení více hmotnostních spektrometrů From Wikipedia, the free encyclopedia
Tandemová hmotnostní spektrometrie, zkráceně MS/MS nebo MS2 je druh instrumentální analýzy, při kterém se propojuje více hmotnostních spektrometrů za účelem přidání dalšího reakčního kroku a zlepšení parametrů analýzy chemických vzorků.[1] Často se používá k analýze biomolekul, jako jsou bílkoviny a peptidy.
Molekuly vzorku se ionizují a první spektrometr (MS1) oddělí vzniklé ionty podle jejich poměru hmotnosti a náboje (značeného m/z nebo m/Q). Ionty o určitých hodnotách m/z-ratio jsou odděleny a následně přeměněny na fragmentované ionty, například srážkami indukovanou disociací, reakcemi iontů s molekulami nebo fotodisociací. Tyto fragmenty poté vstupují do druhého hmotnostního spektrometru (MS2), kde se opět rozdělí podle m/z a jsou detekovány. Fragmentační krok umožňuje identifikaci a oddělení iontů s velmi podobnými hodnotami m/z v běžných hmotnostních spektrometrech.
K druhům tandemové hmotnostní spektrometrie na základě uspořádání patří například trojitý kvadrupólový hmotnostní spektrometr (qqq), čtyřnásobný spektrometr doby letu (Q-tof) a hybridní hmotnostní spektrometr.
Trojité kvadrupólové hmotnostní spektrometry používají první a třetí kvadrupól jako hmotnostní filtry. Při průchodu analytů druhým kvadrupólem dochází k fragmentaci srážkami jejich molekul s plynem. Toto uspořádání je nejběžnější ve farmaceutickém průmyslu.
Kvadrupólové spektrometry doby letu (Q-tof) spojují hmotnostní spektrometrii doby letu a kvadrupólové hmotnostní spektrometry, čímž se dosahuje vysoké hmotnostní přesnosti u vytvořených iontů a využitelnosti fragmentačních experimentů. Poměr (m/z) je zde určován měřením doby letu iontů.
Hybridní hmotnostní spektrometr je soustava vzniklá propojením více než dvou hmotnostních spektrometrů.
Při tandemové hmotnostní spektrometrii v prostoru jsou separační zařízení fyzicky oddělená, i když jsou jednotlivé prvky stále propojené, aby bylo zachováno vysoké vakuum. Těmito prvky mohou být sektory, kvadrupóly nebo spektrometry doby letu. Je-li použito více kvadrupólových spektrometrů, tak mohou sloužit jako hmotnostní analyzátory i srážkové komory.
Pro hmotnostní analyzátory se obvykle používá toto značení Q – kvadrupólový hmotnostní analyzátor; q – radiofrekvenční kolizní kvadrupól; TOF – hmotnostní analyzátor doby letu; B – magnetický sektor a E – elektrický sektor. Značení je možné při označování kombinovaných zařízení spojovat, například QqQ' – trojitý kvadrupólový hmotnostní spektrometr; QTOF – kvadrupólový hnotnostní spektrometr doby letu (také značený QqTOF) a BEBE – čtyřsektorový hmotnostní spektrometr (s obrácenou geometrií).
U tandemové hmotnostní spektrometrie v čase separace probíhá společně se zachytáváním iontů na stejném místě, přičemž dojde k několika separačním krokům. Používají se například kvadrupólové iontové pasti a iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací (FTICR).[2] Analýza se může skládat z několika kroků, pak se někdy používají zkratky ve tvaru MSn;[3] například MS3 označuje třífázovou separaci.
Přístroje na tandemovou hmotnostní spektrometrii v čase nevyužívají níže popsané režimy, ale obvykle získávají data skenováním prekurzorů iontů v rámci celého spektra. Každé uspořádání zařízení představuje jedinečný způsob analýzy.
Při provádění tandemové MS v prostoru existuje několik režimů provozu soustavy. Existuje řada různých druhů seřazení přístrojů a každá má své využití a poskytuje jiné údaje. Tandemová hmotnostní spektrometrie v prostoru spojuje dva přístroje, které měří spektra ve stejném rozsahu, ovšem s kontrolovanou tvorbou fragmentů, zatímco tandemová MS v čase využívá iontové pasti.
Existují čtyři hlavní uspořádání MS/MS: detekce prekurzorových iontů, detekce produktových iontů, ztráty neutrálních částic a sledování vybraných reakcí.
U detekce prekurzorových iontů se ionty produktu třídí ve druhém hmotnostním analyzátoru a ionty prekurzoru v prvním.
V detekci produktových iontů se třídí ionty prekurzoru v prvním spektrometru, což dovoluje třídění fragmentů a dalších vzniklých částic ve druhém hmotnostním analyzátoru a detekci detektorem umístěným za druhým hmotnostním analyzátorem. Tato metoda se používá k identifikaci procesů využívaných k určení množství látek pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie.
Při zkoumání ztráty neutrálních částic zkoumá první hmotnostní analyzátor všechny částice. Druhý analyzátor pak zkoumá částice s určitým posunem oproti prvnímu analyzátoru.[4] Tento posun odpovídá ztrátě neutrální částice. Při zkoumání konstantní ztráty se sledují všechny prekurzory, u kterých dochází k oddělení konkrétní částice. Oba hmotnostní analyzátory neprovádějí detekci současně, ale s určitým posunem odpovídajícím hmotnosti příslušné neutrální částice. Podobně jako u zkoumání prekurzorových iontů se tento postup dá použít k selektivní identifikaci strukturně podobných sloučenin.
Při zkoumání vybraných reakcí jsou oba analyzátory nastaveny na stejnou hmotnost. Jedná se o selektivní analytickou metodu, která vykazuje vysokou citlivost.[5]
Fragmentace iontů v plynné fázi je pro tandemovou hmotnostní spektrometrii důležitá; dochází k ní v různých fázích analýzy. K fragmentaci iontů se používají různé postupy, které se mohou lišit způsoby fragmentace a tedy i druhem informací o struktuře a složení molekul, která je možné pomocí nich získat.
Často je samotná ionizace dostatečně silná na to, aby se fragmenty vytvářely už ve hmotnostním spektrometru. Pokud ionty produktu zůstanou v nerovnovážném stavu dostatečně dlouhou dobu před autodisociací, pak se jedná o metastabilní fragmentaci.[6] Fragmentaci ve zdroji lze v tandemové hmotnostní spektrometrii použít prostřednictvím metody EISA, při níž fragmentace přímo odpovídá datům z tandemové hmotnostní spektrometrie.[7]
Fragmenty pozorované při EISA mají vyšší intenzitu signálu než běžné fragmenty, které ztrácejí energii srážkami.[8]
EISA umožňuje získat data o fragmentaci u MS1 hmotnostních analyzátorů, jako jsou přístroje založené na době letu a jednoduchá kvadrupólová zařízení. Fragmentace uvnitř zdroje se často používá k umožnění dvoukrokové fragmentace u pseudo MS3 experimentů.[9]
Postzdrojová fragmentace se v tandemové hmotnostní spektrometrii používá nejčastěji. Energie se dodává iontům, které jsou již většinou vibračně excitované srážkami s neutrálními atomy nebo molekulami, absorpcí záření, nebo přenosy či záchyty elektronů ionty s vícenásobnými náboji. Srážkami indukovaná disociace, také někdy nazývaná aktivovaná disociace, spočívá ve srážkách iontů s neutrálními částicemi v plynné fázi a následné disociaci iontů.[10][11]
Tento proces lze popsat následujícím schématem:
kde se ion AB+ sráží s neutrální částicí M a poté se rozpadá. S ohledem na různé konfigurace přístroje se objevují dva hlavní typy disociace: (i) paprskový (kdy jsou ionty prekurzoru fragmentovány během letu)[12] a (ii) iontová past (při které jsou ionty prekurzoru nejprve zachyceny, a až poté fragmentovány).[13][14]
Třetím, novějším, typem srážkami indukované disociace je srážková disociace při vyšších energiích (HCD). Jedná se o techniku specifickou pro orbitrapové hmotnostní spektrometry, u nichž fragmentace probíhá mimo iontovou past,[15][16] proces probíhá v HCD komorách (v některých přístrojích nazývaných "iontové směrovací multipóly").[17]
HCD je fragmentační metoda typu iontové pasti, která má určité vlastnosti odpovídající paprskovému typu.[18][19] Existují volně dostupné databáze pro tandemovou hmotnostní spektrometrii, jako například METLIN, zahrnující 850 000 molekulových standardů s příslušnými experimentálními CID MS/MS daty);[20] obvykle se využívají k identifikaci menších molekul.
Energie uvolněná při záchytu elektronů na vícenásobně nabitých iontech či při přenosu elektronů mezi nimi může způsobovat fragmentaci.
Pokud je elektron zachycen vícenásobně nabitým kladným iontem, tak se uvolní Coulombova energie; příslušný proces se nazývá disociace záchytem elektronu (ECD):[21]
kde M je vícekrát protonovaná molekula.
Navázání elektronu při reakci dvou iontů se nazývá disociace přenosem elektronu (ETD).[22][23]
Podobně jako u disociace záchytem elektronu ETD vyvolává fragmentaci kationtů (například peptidových nebo bílkovinových) přenášením elektronů na tyto částice. Tuto metodu objevili Donald F. Hunt, Joshua Coon, John E. P. Syka a Jarrod Marto na Univerzitě ve Virginii.[24]
ETD nevyužívá volné elektrony, ale radikálové anionty (odvozené například od anthracenu či azobenzenu):
kde A je anion.[25]
ETD způsobuje štěpení náhodně podél hlavního peptidového řetězce (za vzniku c- a z iontů), zatímco vedlejší řetězce a modifikace, jako je fosforylace, jí zasaženy nejsou. Technika dobře funguje pouze u iontů s většími náboji (z>2), ovšem podobně jako u srážkami vyvolávané disociace (CID) lze pomocí ETD fragmentovat i větší peptidy až bílkoviny, což má využití v proteomice. Podobně jako ECD je ETD dobře využitelnou metodou u peptidů s posttranslačními modifikacemi, jako je fosforylace.[26]
Disociace přenosem elektronů a disociace srážkami s vyšší energií (EThcD) je kombinací ETD a HCD, kde peptidový prekurzor vstupuje do iontovo/iontových reakcí s anionty fluoranthenu v lineární iontové pasti, která vytváří c- a z-ionty.[22][27]
V druhém kroku se použije HCD fragmentace na všechny ionty vytvořené pomocí ETD, čímž vzniknou b- a y ionty, jež jsou nakonec analyzovány v orbitrapovém analyzátoru.[15] Při této metodě se používá dvojí fragmentace, protože se tvoří velké množství iontů a MS/MS spektra jsou tak bohatá na data využitelná při sekvencování peptidů a hledání posttranslačních modifikací.[28]
Fragmentace také může probíhat u deprotonovaných částic, kdy z nich elektrony přecházejí na kationtové reaktanty v procesu nazývaném negativní disociace s přenosem elektronů (NETD):[29]
Po této reakci u aniontu dojde ke vnitřnímu přesmyku a fragmentaci. NETD je iont/iontovou obdobou disociace odštěpením elektronů (EDD).
NETD je možné použít k fragmentaci peptidů podél hlavního řetězce na vazbách Cα-C. Vzniklé fragmenty jsou obvykle typu a•- a x.
Disociace odštěpením elektronů (EDD) slouží k fragmentaci aniontů.[30]
Jedná se o protipól disociace záchytem elektronů. Záporně nabité ionty se aktivují ozářením elektrony se středně vysokými kinetickými energiemi. Dojde tak k odštěpení elektronů z původní iontové molekuly a v důsledku rekombinace k disociaci.
Reakce kladně nabitých peptidů s kationtovými reaktanty,[31] známá jako disociace přenosem náboje (CTD),[32] byla uznána za alternativní metodu vysokoenergetické fragmentace peptidových iontů s nízkými náboji (+1 nebo +2). Navržený mechanismus CTD s využitím heliových kationtů jako reaktantů vypadá takto:
Bylo zjištěno, že CTD vyvolává Cα-C štěpení vazeb na hlavních řetězcích peptidů a vznikají při něm ionty druhu a•- a x.
Energii potřebnou k fragmentaci může dodat foton, jehož absorpcí dojde k fotodisociaci iontu podle následujícího schématu:
kde je foton absorbovaný iontem. Lze použít ultrafialové lasery, které však způsobují nadměrnou fragmentaci.[33]
Fotony infračerveného záření při absorbování v dostatečném množství zahřívají ionty a způsobují jejich disociaci. Tento proces se nazývá vícefotonová infračervená disociace (IRMPD) a obvykle se provádí pomocí CO2 laseru a hmotnostního spektrometru s iontovou pastí, například FTMS.[34]
Záření černého tělesa lze využít k fotodisociaci v metodě nazývané disociace infračerveným zářením černého tělesa.[35]
Při této metodě se vakuová komora hmotnostního spektrometru zahřívá a vyzařuje tak infračervené záření. Toto záření vyvolává vibrace iontů, které nakonec vedou k zániku vazeb a tvorbě fragmentů.[35][36]
Tento postup se podobá vícefotonové infračervené disociaci, při které se ovšem infračervené záření získává jiným způsobem.[11] Obvykle se používá společně s cyklotronovou rezonancí iontů s Fourierovou transformací.
Při povrchem indukované disociaci (SID) je fragmentace způsobována srážkami iontů s povrchem ve vysokém vakuu.[37][38]
SID lze použít k fragmentaci mnoha různých iontů. Původně se tato metoda běžně používala pouze u iontů s nízkými molekulovými hmotnostmi a s jednotkovými náboji, protože metody ionizace a hmotnostní analýzy ještě nebyly dostatečně vyvinuté ke zkoumání iontů s vysokým m/z. Postupně se však začaly používat jednovrstvé povrchy SAM tvořené CF3(CF2)10CH2CH2S na vrstvě zlata. SAM jsou pro tento účel vhodné, protože mají vysoké efektivní hmotnosti při srážkách s ionty a navíc jsou tvořeny nereaktivními fluorouhlovodíkovými řetězci, které výrazně snižují energie dopadajících iontů. Fluorouhlovodíky taktéž omezují přenos elektronů z povrchu kovu na ionty.[39]
Možností SID vytvářet stabilní subkomplexy, které poskytují využitelné informace o struktuře, nelze dosáhnout žádnou jinou známou technikou. Díky tomu, že jsou tyto komplexy stabilní a zachovávají rozdělení náboje na fragmentu, tak lze získat jedinečná spektra s komplexy majícími užší rozdělení m/z. Produkty této metody a jejich energie odpovídají vždy síle a topologii komplexu. Jedinečné vzory disociace umožňují zjistit kvaternární struktury. Symetrické rozdělení náboje a disociace jsou typické pro SID a mají za následek spektra odlišná od ostatních disociačních jednotek.[39]
SID lze využít i ve ihmotnostní spektrometrii iontové pohyblivosti (IM-MS). Objevuje se zde trojice metod, pro určení topologie, propojení podjednotek, a rozvinování struktury. Analýza rozvinování struktury je nejčastějším způsobem využití SID. U hmotnostní spektrometrie iontové pohyblivosti (IM-MS) SID slouží k disociaci zdrojů aktivovaných prekurzorů tří různých typů proteinových komplexů: C-reaktivního proteinu (CRP), transthyretinu (TTR) and konkanavalinu A (Con A). Při analýze míry rozvinování SID zobrazuje strukturu prekurzorových iontů před srážkou s povrchem. IM-MS využívá SID jako způsob potvrzení struktury každé podjednotky.[40]
Cyklotronovou rezonancí s Fourierovou transformací (FTICR) je možné získat velmi vysoké rozlišení a vysokou hmotnostní přesnost. Díky těmto vlastnostem jsou FTICR hmotnostní spektrometry užitečné v mnoha oblastech, jako jsou některé disociační experimenty,[41] jako jsou srážkami indukovaná disociace (CID) a disociace přenosem elektronů (ETD).[42] FTICR s povrchem indukovanou disociací byl využit při výzkumu fragmentace peptidů, konkrétně šlo o energetiku a kinetiku fragmentace v plynné fázi uvnitř ICR přístroje.[43]
Díky tomuto experimentu byla lépe prozkoumaná fragmentace protonovaných peptidů, peptidových iontů s lichým počtem elektronů, nekovalentních ligand-peptidových komplexů a ligandovaných shluků kovů.
Kvantitativní proteomika slouží k určení relativního nebo absolutního množství bílkovin ve vzorku.[44][45][46]
Několik kvantitativních proteomických metod je založeno na tandemové hmotnostní spektrometrii. MS/MS je důležitá při určování struktur velkých biomolekul.[47]
Jednou z těchto metod je izobarické značkování, které umožňuje současnou identifikaci a kvantifikaci proteinů z různých vzorků během jediné analýzy. Za účelem kvantifikace se peptidy značkují chemickými značkami se stejnou strukturou a molekulovou hmotností, které se však liší zapojením těžších izotopů do své struktury. Tyto značky, často označované jako tandemové hmotnostní značky, jsou vyvinuty tak, aby byly odštěpeny ve specifické oblasti pomocí srážkové disociace při vyšších energiích (HCD) v průběhu tandemové hmotnostní spektrometrie za vzniku iptů o různých hmotnostech. Kvantifikace se provádí srovnáním intenzit signálů těchto iontů v MS/MS spektru. K dostupným značkám patří iTRAQ a TMT.
Izobarická značka pro relativní a absolutní kvantifikaci (iTRAQ) je reaktant pro tandemovou hmotnostní spektrometrii používaný k určení obsahu bílkovin z různých zdrojů při jediné analýze.[48][49][50]
V této metodě se molekuly značkují stabilními izotopy, které mohou tvořit kovalentní vazby s N-konci a aminovými skupinami v postranních řetězcích. iTRAQ reaktanty se použijí ke značkování peptidů z různých vzorků, které jsou poté spojeny a analyzovány kapalinovou chromatografií a tandemovou hmotnostní spektrometrií. Fragmentací připojené značky vznikají nízkomolekulární ionty, jež mohou být použity k relativní kvantifikaci peptidů a proteinů, ze kterých byly vytvořeny.
Teandemové hmotnostní značky (TMT) je izobarická hmotnostní značka používaná při identifikaci a kvantifikaci proteinů.[51] Díky TMT reaktantům je možné současně analyzovat 2 až 11 různých vzorků peptidů získaných z buněk, tkání nebo tělních tekutin. K dispozici jsou tři druhy TMT reaktantů, přičemž každý má jinou reaktivitu: (1) reaktivní NHS estery ke značení primárních aminů (TMTduplex, TMTsixplex, TMT10plex plus TMT11-131C), (2) jodacetylové skupiny ke značení volných sulfhydrylů (iodoTMT) a (3) alkoxyaminy ke značení karbonylových skupin (aminoxyTMT).
Tandemová hmotnostní spektrometrie může být využita při sekvenování bílkovin.[52] Zkoumané proteiny mohou být přímo aplikovány do hmotnostního analyzátoru, nebo je lze rozložit na menší peptidové řetězce a až poté analyzovat. Další možností je rozklad proteinů na peptidy ještě před separací a provedením analýzy hmotnostní spektrometrií.
Tandemová hmotnostní spektrometrie může vytvářet peptidové sekvenční značky, které lze použít k identifikaci proteinu s využitím databází.[53][54][55]
Byla vyvinuta notace k popisu fragmentů vznikajících v tandemové hmotnostní spektrometrii.[56]
Fragmenty peptidových iontů se označují a, b, nebo c, jestliže zůstává zachovaný náboj na N-konci a x, y, nebo z, když zůstává zachován náboj na C-konci. Pomocí dolního indexu se pak označí počet aminokyselinových zbytků ve fragmentu. K označení ztrát neutrálních molekul při fragmentaci vedlejších řetězců, * při odštěpení amoniaku a ° pro odštěpení vody. I když je štěpení vedlejších řetězců pro sekvenování a identifikaci peptidů nejvhodnější, tak lze při disociaci za vysokých energií pozorovat i jiné fragmentované ionty; patří sem odštěpení d, v, w a amonných iontů z postranního řetězce[57][58] i jiné sekvenčně specifické fragmentované ionty související s konkrétními aminokyselinovými zbytky.[59]
Oligosacharidy mohou být pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie sekvencovány podobně jako peptidy.[60]
Fragmentace většinou nastává na obou koncích glykosidové vazb (vznikají b, c, y a z ionty), ovšem za vyšších energií dochází ke štěpení i na sacharidovém kruhu (za tvorby x iontů). I zde se k označení polohy místa rozštěpení na řetězci používají dolní indexy; při popisu štěpení napříč cykly jsou používány horní indexy.[61][62]
Tandemová hmotnostní spektrometrie může být použita i při sekvenování DNA a RNA.[63][64]
Byla navržena notace pro fragmentaci oligonukleotidů v plynné fázi.[65]
Tandemovou hmotnostní spektrometrii nelze použít na analýzu na úrovni jednotlivých buněk, protože na takové úrovni není dostatečně citlivá. Toto omezení je způsobeno hlavně neefektivní tvorbou iontů a jejich ztrátou působením rozpouštědel.[66]
Tandemová hmotnostní spektrometrie je užitečnou metodou při zkoumání proteinů, komplexů nukleoproteinů, i jiných biomolekul.[67]
Seamless Wikipedia browsing. On steroids.
Every time you click a link to Wikipedia, Wiktionary or Wikiquote in your browser's search results, it will show the modern Wikiwand interface.
Wikiwand extension is a five stars, simple, with minimum permission required to keep your browsing private, safe and transparent.