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DNA聚合酶（DNA Polymerase，EC編號2.7.7.7）是一種參與DNA複製的酶。它主要是以模板的形式，催化脫氧核糖核苷酸的聚合。聚合後的分子將會組成模板鏈並再進一步參與配對。
DNA聚合酶以脫氧核苷酸三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、或dTTP，四者統稱dNTPs）為基質，沿模板的3'→5'方向，將對應的脫氧核苷酸連接到原有DNA鏈的3'端，使新生鏈沿5'→3'方向延長。新鏈與原有的模板鏈序列互補，亦與模板鏈的原配對鏈序列一致。
已知的所有DNA聚合酶均以5'→3'方向合成DNA，且均不能「重新」（de novo）合成DNA，而只能將脫氧核苷酸加到已有的RNA或DNA的3'端羥基上。因此，DNA聚合酶除了需要模板做為序列指導，也必需引子來起始合成。合成引子的酶叫做引發酶。
反應式：
1957年，美國科學家阿瑟·科恩伯格（Arthur Kornberg）首次在大腸桿菌中發現DNA聚合酶，這種酶被稱為DNA聚合酶I（DNA polymerase I，簡稱：Pol I）。1970年，德國科學家羅爾夫·克尼佩爾斯（Rolf Knippers）發現DNA聚合酶II（Pol II）。隨後，DNA聚合酶III（Pol III）被發現。原核生物中主要的DNA聚合酶及負責染色體複製的是Pol III。
細菌中，已有數種DNA聚合酶被發現。
DNA聚合酶介導的DNA合成起始於引子（primer）和DNA配對，配對的引子3'端帶有一個自由的羥基，隨後是在DNA聚合酶的催化下由這個自由羥基氧上的配對電子攻擊三磷酸鹼基上的磷原子的親核取代，繼而在戊糖和磷酸之間形成脂鍵從而完成一個鹼基的延伸。
在整個過程中，能量是由三磷酸鹼基所攜帶的高能磷酸鍵提供的，磷酸酯形成以後，一個焦磷酸分子脫落，焦磷酸分子再次分裂提供足夠的能量給DNA聚合過程。
不同的DNA聚合酶廣泛應用於分子生物學實驗[1]。
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