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磷酸化(英語:Phosphorylation)或稱磷酸化作用,是指在蛋白質或其他類型分子上,加入一個磷酸(PO32-)基團,也可定義成「將一個磷酸基團導入一個有機分子」。此作用在生物化學中佔有重要地位。
蛋白質磷酸化可發生在許多種類的胺基酸(蛋白質的主要單位)上,其中以絲胺酸為多,接著是蘇胺酸。而酪胺酸則相對較少磷酸化的發生,不過由於經過磷酸化之後的酪氨酸較容易利用抗體來純化,因此酪氨酸的磷酸化作用位置也較廣為了解。
除了蛋白質以外,部分核苷酸,如三磷酸腺苷(ATP)或三磷酸鳥苷(GTP)的形成,也是經由二磷酸腺苷和二磷酸鳥苷的磷酸化而來,此過程稱為氧化磷酸化。另外在許多醣類的生化反應中(如糖解作用),也有一些步驟存在氧化磷酸化作用。
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