酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)又称酵素免疫分析法,简称酶联法酶免[1],是利用抗原抗体之间专一性键结之特性,对检体进行检测的分析方法;由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上的抗原或抗体仍可具有免疫活性,因此设计其键结机制后,配合酵素呈色反应,即可显示特定抗原或抗体是否存在,并可利用呈色的深浅进行定量分析[2][3]

用于酶联免疫吸附测定的 96 孔板

酶联法的一项重要应用为用于HIV检测,其检测的蛋白一般为HIV的p24蛋白 (P24 capsid protein英语P24 capsid protein)。根据待测样品与键结机制的不同,ELISA可设计出各种不同类型的检测方式,主要以三明治法(sandwich)、间接法(indirect)、以及竞争法(competitive)三种为主。

三明治法

三明治法常用于检测大分子抗原,一般之操作步骤为:

  1. 将具有专一性之抗体固着(coating)于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体
  2. 加入待测检体,检体中若含有待测之抗原,则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结
  3. 洗去多余待测检体,加入另一种对抗原专一之一次抗体,与待测抗原进行键结
  4. 洗去多余未键结一次抗体,加入带有酶之二次抗体,与一抗键结
  5. 洗去多余未键结二次抗体,加入酶底物使酶显色,以肉眼或仪器读取显色结果

三明治法分别以两种抗体对检体中的抗原进行两次专一性辨认,因此专一性相当高,但此待测抗原必须是多价抗原,如此才可获得两种以上的专一性抗体,以分别进行夹心;而且此法需要足够的表位空间以进行抗原抗体的夹心,所以并不适用于半抗原或小分子抗原等分子量较小之标的。

间接法

间接法常用于检测抗体,一般之操作步骤为:

  1. 将已知之抗原固着于塑胶孔盘上,完成后洗去多余之抗原
  2. 加入待测检体,检体中若含有待测之一次抗体,则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结
  3. 洗去多余待测检体,加入带有酵素之二次抗体,与待测之一次抗体键结
  4. 洗去多余未键结二次抗体,加入酵素底物使酵素呈色,藉仪器(ELISA reader)测定塑胶盘中的吸光值(OD值),以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。

竞争法

竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制,一般用于检测小分子抗原,其操作步骤为:

  1. 将具有专一性之抗体固着于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体
  2. 加入待测检体,使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结
  3. 加入带有酵素之抗原,此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结,由于塑胶孔盘上固着的抗体数量有限,因此当检体中抗原的量越多,则带有酵素之抗原可键结的固着抗体就越少,亦即,两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结,即所谓竞争法之由来。
  4. 洗去检体与带有酵素之抗原,加入酵素底物使酵素呈色,当检体中抗原量越多,代表塑胶孔盘内留下之带有酵素的抗原越少,显色也就越浅。

当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原,或是不易得到足够的纯化抗体以固着于孔盘上时,一般会考虑使用竞争法ELISA。

注释

外部链接

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