Морфоли́новые олигонуклеоти́ды[1][2][3], или морфоли́новые олигоме́ры[4] (англ. morpholino, morpholino oligomer, phosphorodiamidate morpholino oligomer, PMO) — синтетические олигонуклеотиды, использующиеся в молекулярной биологии для изменения экспрессии генов. Основу молекулярной структуры морфолинового олигонуклеотида составляют метиленморфолиновые кольца и фосфородиамидатные связи. Морфолиновые олигонуклеотиды блокируют доступ других молекул к небольшим (длиной около 25 нуклеотидов) специфическим последовательностям за счёт комплементарного спаривания с соответствующей РНК. Морфолиновые олигонуклеотиды служат исследовательскими инструментами в обратной генетикe для нокдауна гена.
Нокдаун гена заключается в предотвращении синтеза клеткой соответствующего белка[5]. Морфолиновые олигонуклеотиды также могут влиять на сплайсинг пре-мРНК[6]. Нокдаун гена является мощным средством для изучения функции конкретного гена. Аналогичным образом, вырезание специфического экзона из транскрипта позволяет определить функции, выполняемые соответствующими аминокислотными остатками белка, а иногда приводит к полной инактивации белка. Морфолиновые олигонуклеотиды используются в изучении многих модельных организмов, в том числе мышей, данио-рерио, лягушек и морских ежей[7].
Разрабатываются пути применения морфолиновых олигонуклеотидов в медицине против патогенных организмов (бактерий[8] и вирусов[9]), а также для ослабления проявления генетических заболеваний[10].
Структура
Морфолиновые олигонуклеотиды — это синтетические молекулы, представляющие собой измененные нуклеиновые кислоты[11]. Они, как правило, имеют длину 25 нуклеотидов и комплементарно связываются с соответствующими последовательностями РНК за счёт спаривания оснований. Морфолиновые олигонуклеотиды имеют обычные азотистые основания, которые вместо дезоксирибозы соединены с кольцами морфолина, а в связи отдельных нуклеотидов участвуют не фосфатные, а фосфородиамидатные группы. Замена отрицательно заряженных фосфатных групп незаряженной фосфородиамидатной группой устраняет ионизацию при физиологических значениях рН, так что в живых клетках эти молекулы не заряжены. Вся молекула морфолинового олигонуклеотида состоит из таких изменённых нуклеотидов[11].
Функции
Механизмы действия морфолиновых олигонуклеотидов
Морфолиновые олигонуклеотиды не вызывают деградации своей РНК-мишени, в отличие от многих антисмысловых молекул (например, малых интерферирующих РНК и фосфоротиоатов[англ.]). Вместо этого они выступают в роли «пространственных блокаторов», связываясь с последовательностью-мишенью и физически не давая другим молекулам связаться с этой РНК[5]. Морфолиновые олигонуклеотиды часто используются для изучения роли специфических мРНК в развивающемся зародыше. Эмбриологи инъецируют их в яйца или зародыши данио-рерио[12], шпорцевой лягушки[13], морских ежей[14] и рыбы Fundulus heteroclitus или доставляют эти молекулы путём электропорации в зародыши курицы на более поздних стадиях развития[15]; обработанные таким образом зародыши называют морфантами. При наличии в цитозоле правильных систем доставки морфолиновых олигонуклеотидов могут быть эффективными и в культурах клеток[16][17].
Блокирование трансляции
Связываясь с 5'-нетранслируемой областью мРНК, морфолиновые олигонуклеотиды могут мешать рибосоме в комплексе с эукариотическими факторами инициации трансляции[англ.] двигаться от кэпа к старт-кодону. Это предотвращает трансляцию кодирующей области транскрипта-мишени (нокдаун гена). Такой приём очень удобен, когда исследователь хочет определить функцию конкретного белка; по эффектам, оказываемым нокдауном гена на клетку или организм, судят о функции белка. Некоторые морфолиновые олигонуклеотиды блокируют экспрессию столь эффективно, что после деградации белка, синтезированного до введения олигонуклеотидов, этот белок становится неопределимым при помощи вестерн-блоттинга[18].
Изменение сплайсинга пре-мРНК
Морфолиновые олигонуклеотиды могут вмешиваться в процессинг пре-мРНК следующими способами:
- предотвращая связывание направляющих сплайсинг малых ядерных рибонуклеопротеинов (snRNP[англ.]) со своими мишенями на границах интронов в пре-мРНК;
- блокируя остаток аденина, осуществляет нуклеофильную атаку в ходе сплайсинга и образует структуру лассо;
- мешая связыванию регуляторных белков сплайсинга, таких как сайленсеры[19] и энхансеры сплайсинга[англ.][20].
Предотвращение связывания рибонуклеопротеинов U1[англ.] (в сайте-доноре) или U2[англ.]/U5[англ.] (в полипиримидиновом тракте[англ.] или сайте-акцепторе) может привести к модифицированному сплайсингу, при котором из зрелой мРНК исключаются экзоны. Воздействие на другие сайты сплайсинга приводит к включению интронов в зрелую мРНК, в то время как активация скрытых сайтов сплайсинга может приводит и к включениям, и к исключениям[21]. Морфолиновые олигонуклеотиды могут также блокировать мишени snRNP U11[англ.]/U12[англ.][22]. Изменения в сплайсинге удобно отслеживать при помощи ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) и электрофореза (при электрофорезе продуктов RT-PCR наблюдается смещение полос в геле)[6].
Другие применения
Морфолиновые олигонуклеотиды использовались для блокировки активности микроРНК[23][24], а также их созревания[25]. Морфолиновые олигонуклеотиды, меченные флуоресцеином, в сочетании с антителами, специфичными к флуоресцеину, могут использоваться в качестве проб in situ-гибридизации[англ.] с микроРНК[26]. Кроме того, они могут блокировать активность рибозимов[27], а также функционирование snRNP U2 и U12[28]. Морфолиновые олигонуклеотиды, нацеленные на «оголённые» последовательности мРНК в пределах кодирующей области, могут вызывать сдвиг рамки считывания[англ.] при трансляции[29]. Они также могут блокировать редактирование РНК. Эффективность морфолиновых олигонуклеотидов по отношению ко многим мишеням делает их универсальным средством для подавления взаимодействия белков или нуклеиновых кислот с мРНК[30].
Специфичность, стабильность и не-антисмысловые эффекты
Морфолиновые олигонуклеотиды стали стандартным инструментом для нокдауна генов в эмбриональных системах животных, в которых экспрессируется больше генов, чем во взрослых клетках. После инъекции морфолинового олигонуклеотида в зародыши лягушки или рыбы на стадии одной или нескольких клеток наибольший эффект проявляется к пятому дню[31], когда большая часть органогенеза и дифференцировки клеток и тканей уже позади; наблюдаемые фенотипы соответствуют нокауту определённого гена. Контрольные[англ.] нуклеотиды, не нацеленные на какие-либо последовательности, как правило, не вызывают изменений в фенотипе зародыша, подтверждая, что морфолиновые олигонуклеотиды действуют специфично к последовательностям и, как правило, не имеют не-антисмысловых эффектов. Дозу, необходимую для нокдауна гена, можно сократить, одновременно вводя несколько морфолиновых олигонуклеотидов, нацеленных на одну и ту же мРНК; этот приём позволяет сократить или вовсе исключить зависимые от дозы взаимодействия олигонуклеотидов с РНК, не являющимися непосредственными мишенями[32].
В экспериментах по «спасению» мРНК у зародышей часто удавалось вернуть фенотип дикого типа. В ходе этих экспериментов морфолиновый олигонуклеотид вводится в клетку вместе с мРНК, кодирующей тот белок, на нокдаун которого этот олигонуклеотид и направлен. Однако вводимая мРНК имеет изменённую 5'-нетранслируемую область, а потому не имеет последовательности-мишени для морфолинового олигонуклеотида, но её кодирующая область сохранена и с неё синтезируется интересующий белок. Трансляция с мРНК-«спасателя» восстанавливает образование белка, остановленное морфолиновым олигонуклеотидом. Спасательная мРНК не вызывает фенотипических отклонений, так как не действует на экспрессию генов, не являющихся мишенью введенного олигонуклеотида, поэтому возврат к фенотипу дикого типа служит ещё одним доказательством специфичности морфолиновых олигонуклеотидов по отношению к последовательности[31].
Из-за совершенно неестественного химического строения морфолиновые олигонуклеотиды не распознаются клеточными белками. Нуклеазы их не разрушают[33], поэтому они не разрушаются ни в клетках, ни в плазме крови[34]. Морфолиновые олигонуклеотиды не активируют Toll-подобные рецепторы, а потому не запускают врождённый иммунный ответ, выражающийся, в частности, в образовании интерферона или в NF-κB-опосредованном воспалении[35].
До 18 % морфолиновых олигонуклеотидов вызывают не связанные с исходными мишенями фенотипы, в частности, смерть клеток центральной нервной системы и сомитов у зародышей данио-рерио[36]. Было показано, что большая часть этих эффектов связана с активацией p53-опосредованного апоптоза; их можно подавить, одновременно вводя экспериментальный морфолиновый олигонуклеотид и его анти-p53-аналог. Более того, вызванную морфолиновым олигонуклеотидом активацию p53-опосредованного апоптоза удалось повторить с использованием других антисмысловых структур, что говорит в пользу того, что p53-опосредованный апоптоз может быть вызван утратой белка-мишени и не зависит от типа олигонуклеотида, используемого для нокдауна[37].
Морфолиновые олигонуклеотиды следует использовать с осторожностью из-за их потенциальных эффектов вне белка-мишени. Для проверки того, является ли наблюдаемый фенотип морфанта результатом нокдауна задуманного гена или же он вызван взаимодействием с РНК, не являющейся непосредственной мишенью введенного олигонуклеотида, можно провести второй эксперимент. Этот эксперимент заключается в повторении фенотипа (фенокопировании) морфанта с использованием другого морфолинового олигонуклеотида, нацеленного на ту же мишень, но не перекрывающегося с первым олигонуклеотидом[31].
Доставка
Для того, чтобы морфолиновый олигонуклеотид мог подействовать, он должен попасть в цитозоль клетки и преодолеть клеточную мембрану. После попадания в цитозоль он начинает свободно диффундировать между цитозолем и ядром, как было показано в экспериментах, при которых введение морфолинового нуклеотида в цитозоль клетки изменяло сплайсинг в ядре[6]. Для доставки морфолинового олигонуклеотида в зародыши, клетки культуры или клетки взрослых животных используются различные методы.
Для доставки в зародыши, как правило, используют микроинъекции[англ.], причём введение олигонуклеотидов обычно осуществляют на стадии одной или нескольких клеток[38]. Альтернативный метод для доставки морфолиновых олигонуклеотидов в эмбрионы — электропорация, которая позволяет доставить их в ткани на более поздних стадиях развития зародыша[39].
Наиболее распространённые методы для доставки морфолиновых олигонуклеотидов в клетки культуры — использование эндопортерного пептида (англ. Endo-Porter peptide), который вызывает высвобождение морфолиновых олигонуклеотидов из эндосом[17]; система специальной доставки (англ. Special Delivery system), использующая гетеродуплекс ДНК с морфолиновым олигонуклеотидом и этоксилированный[англ.] полиэтиленимин[англ.] в качестве реагента доставки (больше коммерчески недоступна)[16]; электропорация[40]; метод соскоба-загрузки (англ. scrape loading)[41]. В 2015 году была описана транс-активирующая амфипатическая система доставки, основанная на ДНК, которая предназначена для удобной доставки незаряженных нуклеиновых кислот, имеющих поли(А)-хвост, таких как пептидо-нуклеиновые кислоты и морфолиновые олигонуклеотиды[42].
Доставка морфолиновых олигонуклеотидов в ткани взрослых животных затруднительна, хотя разработано несколько систем, позволяющих доставить в ткани немодифицированные морфолиновые олигонуклеотиды (в частности, в от природы слабые мышечные клетки при мышечной дистрофии Дюшена[43] или в клетки сосудистого эндотелия, подвергающиеся стрессу при ангиопластии[англ.][44]). Хотя морфолиновые олигонуклеотиды эффективно проходят через межклеточные промежутки в тканях, доставка их в клетки сложна. Системная доставка в клетки многих типов может быть осуществлена при помощи морфолиновых олигонуклеотидов, ковалентно связанных с проникающими в клетки пептидами[англ.] (англ. Cell-penetrating peptide), и, в то время как токсичный эффект оказывают средние дозы связанных пептидов[45][46], в условиях in vivo удалось добиться эффективной доставки морфолиновых олигонуклеотидов при дозах пептидов ниже токсичных[9][47]. Октагуанидиновый дендример, прикреплённый к концу морфолинового олигонуклеотида (т. н. Vivo-Morpholino), обеспечивает его доставку из крови в цитозоль при систематическом введении во взрослого животного[48][49].
Медицинское значение
Морфолиновые олигонуклеотиды, способные к эффективной доставке (такие как связанные с пептидами морфолиновые олигонуклеотиды и Vivo-Morpholino), могут быть перспективными средствами для лечения вирусных и генетических заболеваний[50]. Например, Sarepta Therapeutics[англ.] Inc. уже разрабатывает морфолиновые олигонуклеотиды — потенциальные лекарства под названием NeuGene. В настоящее время проходят клинические испытания морфолиновые олигонуклеотиды, которые могут использоваться для лечении миодистрофии Дюшенна у человека[51].
Примечания
Литература
Ссылки
Wikiwand in your browser!
Seamless Wikipedia browsing. On steroids.
Every time you click a link to Wikipedia, Wiktionary or Wikiquote in your browser's search results, it will show the modern Wikiwand interface.
Wikiwand extension is a five stars, simple, with minimum permission required to keep your browsing private, safe and transparent.
