Зимография

Зимография — электрофоретическая технология, основанная на SDS-PAGE, которая включает субстратную сополимеризацию с полиакриламидным гелем, для обнаружения ферментативной активности. Образцы готовят в стандартно обработанном SDS-PAGE буфере, но без кипячения и без редуцирующего агента. После электрофореза, SDS удаляется из геля (или зимограммы) выдерживанием в небуферезированном Тритон X-100, затем следует выдерживание в подходящем расщепляющем буфере, за оптимальный отрезок времени при 37 °C. Далее, зимограмма окрашивается (обычно Амидным Чёрным и Кумасси брильянтовым голубым), при этом, в том месте, где субстрат был расщеплён ферментом, проявляются области расщепления в виде отчётливых полосок на тёмно окрашенном фоне. Эти протоколы, однако, нуждаются в сильных уточнениях. Например, пищеварительная гликозидаза D. melanogaster выживает в редуцированных условиях (то есть в присутствии 2-меркаптоэтанола или DTT) и при объёмном подогреве.

Действительно, разделение дальнейшим нагреванием до 50 °C приводит к явному увеличению разрешения полос, без существенных потерь активностей.

Plasmodium knowlesi Отпечаток гемоглобиназы. ^[1]

Желатин — это наиболее стандартный из используемых субстратов и может быть полезен для демонстрации активности желатин разрушающих протеаз, но зимография может быть применена и к широкому кругу ферментов, включающему ксиланазы, протеазы, липазы, хитаназы, и т. д.

Общий протокол, используемый в прошлом для зимографии альфа-амилазной активностей, был назван протоколом тонкого слоя крахмала W. W. Doane. По этому протоколу исходный PAGE гель запускался для разделения белков в гомогенате. После этого тонкий гель с растворённым в нём крахмалом (или точнее, суспензированным) покрывался сверху исходным гелем на некоторое время. Крахмал окрашивался раствором Люголя.

Обратная зимография сополимеризует как субстрат, так и фермент с акриламидом, и это полезно для демонстрации активности ингибитора фермента. При последующем окрашивании, участки ингибирования визуализируются как тёмные пятна на чистом (или светлоокрашенном фоне).

Ссылки

1. Hempelmann, E., Putfarken, B., Rangachari, K., Wilson, R.J.M. Immunoprecipitation of malarial acid endopeptidase (неопр.) // Parasitology. — 1986. — Т. 92. — С. 305—312. — PMID 3520446.