Reação em cadeia da polimerase
método invitro de cópia de sequencias de RNA ou DNA / De Wikipedia, a enciclopédia encyclopedia
A reação em cadeia da polimerase - RCP[1] em inglês polymerase chain reaction - PCR[2] é uma técnica utilizada na biologia molecular para amplificar uma única cópia ou algumas cópias de um segmento de DNA em várias ordens de grandeza, gerando milhares a milhões de cópias de uma determinada sequência de DNA.
Desenvolvida em 1983 por Kary Mullis, que era um funcionário da Cetus Corporation, e também o vencedor do Prêmio Nobel de Química em 1993 junto com Michael Smith,[3] é uma maneira fácil, barata e confiável de replicar repetidamente um segmento específico de DNA, um conceito aplicável a vários campos da biologia moderna e das ciências relacionadas. O PCR é provavelmente a técnica mais utilizada na biologia molecular. Esta técnica é utilizada na pesquisa biomédica, nas técnicas forenses e na arqueologia molecular.
O PCR é agora uma técnica comum e frequentemente indispensável usada em laboratórios clínicos e de pesquisa para uma ampla variedade de aplicações.[carece de fontes?] Estas incluem a clonagem de DNA para sequenciação, clonagem e manipulação de genes, mutagênese de genes; construção de filogenias baseadas em DNA, ou análise funcional de genes; diagnóstico e monitoramento de doenças hereditárias; amplificação do DNA antigo;[4] análise de impressões digitais genéticas para o perfil de DNA (por exemplo, na ciência forense e teste de parentesco); e deteção de patógenos em testes de ácido nucleico para o diagnóstico de doenças infecciosas.
A grande maioria dos métodos de PCR dependem do ciclo térmico, o que envolve a exposição dos reagentes a ciclos de aquecimento e resfriamento repetidos, permitindo diferentes reações dependentes da temperatura - especificamente, a fusão do DNA e a replicação de DNA orientada por enzimas - para prosseguir rapidamente várias vezes em sequência. Os iniciadores (fragmentos de DNA curtos) que contêm sequências complementares à região alvo, juntamente com uma polimerase de DNA (por exemplo, Taq polimerase), graças à o qual o método foi designado, permitem amplificação seletiva e repetida. À medida que a PCR progride, o DNA gerado é usado como um modelo para replicação, colocando em movimento uma reação em cadeia na qual o modelo de DNA original é amplificado exponencialmente. A simplicidade do princípio básico subjacente à PCR significa que pode ser amplamente modificada para realizar uma ampla gama de manipulações genéticas. A PCR não é geralmente considerada um método de DNA recombinante, pois não envolve cortar e colar DNA, apenas amplificação de sequências existentes.
Quase todas as aplicações de PCR empregam uma polimerase de DNA estável ao calor, como a polimerase Taq, uma enzima originalmente isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus. Se a DNA polimerase sensível ao calor for utilizada, ela irá desnaturar todos os ciclos no passo de desnaturação. Antes do uso da Taq polimerase, a DNA polimerase tinha que ser adicionada manualmente a cada ciclo, no que era um processo entediante e dispendioso.[5] Esta DNA polimerase monta enzimaticamente uma nova cadeia de DNA a partir de nucleotídeos livres, os blocos de construção de DNA, usando DNA de cadeia simples como molde e oligonucleótidos de DNA (os iniciadores mencionados acima) para iniciar a síntese de DNA.
O PCR, como a tecnologia de DNA recombinante, teve um enorme impacto[1] nos aspectos básicos e diagnósticos da biologia molecular porque pode produzir grandes quantidades de um fragmento de DNA específico a partir de pequenas quantidades de um modelo complexo. As técnicas de DNA recombinante criam clones moleculares ao conferir a uma sequência específica a capacidade de replicar inserindo-a em um vetor e introduzindo o vetor em uma célula hospedeira. O PCR representa uma forma de "clonagem in vitro" que pode gerar, bem como modificar, fragmentos de DNA de comprimento definido e seqüência em uma simples reação automatizada. Além de suas muitas aplicações na pesquisa biológica molecular básica, o PCR promete desempenhar um papel crítico na identificação de seqüências médicamente importantes, bem como um diagnóstico importante na sua detecção.