DNAトポイソメラーゼ(DNA topoisomerases)とは、2本鎖DNAの一方または両方を切断し再結合する酵素の総称である。
環状の2重鎖DNAでは、2本の鎖は位相幾何学(トポロジー)的には結び目があるのと等価であり、ねじれ数の異なるDNA、つまりトポアイソマー(トポロジーの異なる異性体)は、DNA鎖を切らない限り互いに変換できない。トポイソメラーゼはこの変換(topoisomerization)を触媒する異性化酵素という意味で命名された。抗がん剤や抗生物質のターゲットとしても知られる。