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L’immunofluorescence est une technique d’immunomarquage, qui utilise des anticorps ainsi que des fluorochromes. L'immunofluorescence permet de révéler une protéine spécifique directement dans la cellule, par émission de fluorescence. Elle permet donc de déterminer non seulement la présence, ou l'absence d'une protéine, mais aussi sa localisation dans la cellule, ou le tissu analysé.
Le phénomène de fluorescence fut découvert au milieu du XIXe siècle par le scientifique anglais Sir George Gabriel Stokes. Il fut le premier à observer que la fluorine, un minéral, devient fluorescente lorsque exposée à des rayons ultraviolets, et il lui donna le nom de "fluorescence".
Les premiers travaux utilisant l'immunofluorescence datent des années 1950, où des anticorps étaient conjugués à des fluorochromes de nature chimique, tels que la fluorescéine[1].
Les premières protéines fluorescentes (semblables aux fluorochromes utilisées en immunofluorescence) furent découvertes bien plus tard, avec le GFP (Green Fluorescent Protein), dans les années 1960, par Osamu Shimomura et Roger Y. Tsien. Issue d'une méduse (Aequorea victoria), la découverte de cette protéine leur valu le prix nobel de chimie en 2008[2]. De nos jours, de nombreux fluorochromes utilisés en immunofluorescence sont des dérivés de la GFP.
Il existe deux types de fluorescence. Tout d’abord, la fluorescence dite « naturelle », ou auto-fluorescence, émise spontanément par la cellule. On peut citer par exemple la chlorophylle des cellules végétales. Ensuite il y a la fluorescence conférée par un fluorochrome, substance chimique qui émet de la lumière si elle est excitée à une certaine longueur d’onde.
En immunofluorescence, on peut réaliser deux types de marquages. Le premier est l’immunofluorescence directe. Lors de ce marquage, on utilise un anticorps dirigé contre la molécule recherchée, appelée antigène. Cet anticorps est couplé à un fluorochrome. Ensuite pour révéler la préparation, on peut utiliser un microscope à épifluorescence ou un microscope confocal. Cette technique reste une des plus utilisées dans la recherche scientifique.
Pour les articles homonymes, voir IFI.
L'immunofluorescence indirecte (IFI) est basée sur l'utilisation successive de 2 anticorps : le premier anticorps de type monoclonal reconnait spécifiquement la protéine d’intérêt. Le second anticorps de type polyclonal est dirigé contre l'anticorps primaire (le premier).
C'est le second marquage. Dans ce cas, on a deux anticorps. L’anticorps primaire est dirigé contre l’antigène recherché. Ensuite on utilise un deuxième anticorps, marqué par un fluorochrome, et possédant une haute affinité pour l’anticorps primaire (dirigé contre l’isotype de l’anticorps primaire, il s'agit alors d'une antiglobuline.)
Comme avantages, il y a la possibilité de réaliser des marquages multiples sur un même échantillon de cellules, la rapidité et la facilité d'utilisation de cette méthode et aussi une bonne fiabilité de celle-ci. De plus en immunofluorescence indirecte, on a une augmentation de l’intensité lumineuse, car il y a plusieurs sites de fixation sur les anticorps primaires, ce qui permet d’avoir plusieurs anticorps secondaires fixés dessus.
Mais il y a quelques inconvénients. Par exemple, la possibilité de réactions faussement positives ou faussement négatives, l'appréciation subjective du degré de fluorescence et le phénomène de photo-blanchiment. Pour pallier ces inconvénients, il existe plusieurs techniques. Tout d’abord, réaliser un témoin négatif pour l’immunofluorescence indirecte, c'est-à-dire ne mettre que les anticorps secondaires (marqués) en contact avec l’échantillon à analyser. Après une étape de lavage, si le témoin négatif est bon, il ne doit pas avoir de fluorescence émise, car les anticorps secondaires n’ont pas pu se fixer, et ils sont donc partis après l’étape de lavage. Ensuite, l’utilisation de caméra haute résolution et haute sensibilité atténue le photoblanchiment et permet une étude quantitative de l'acquisition.
Bien que le principe de l'immunofluorescence soit simple, de nombreux facteurs sont à prendre en compte en pratique[6].
On peut distinguer trois domaines :
L'immunofluorescence est utilisée sur les cellules en culture (on parlera alors d'immunocytochimie) ou sur des coupes de tissus (immunohistochimie).
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