From Wikipedia, the free encyclopedia
Maatriksi assisteeritud laserdesorptsioon-ionisatsioon (MALDI) on pehme ionisatsioonitehnika, mida kasutatakse massispektromeetrias. MALDI avardas makromolekulide, näiteks DNA, valkude, polümeeride) massispektromeetrilisi analüüsivõimalusi. MALDI võimaldab saada teiste laiemalt levinud pehmete ionisatsioonitehnikatega võrreldes rohkem ühelaengulisi fragmenteerimata ioone.[1]
MALDI puhul neelab kiirgust maatriks ning energiaülekanne analüüdile toimub peamiselt soojusülekande kaudu, samas pole ioonide tekkemehhanism päris selge, kuid selle kohta on esitatud mitu teooriat.[2]
Kõrgmolekulaarsete ühendite uurimine oli enne MALDI välja töötamist raskendatud. Elektronionisatsiooni toimel nad fragmenteeruvad ning elektropihustusionisatsioon tekitab mitmelaengulisi ioone, mis mõningate analüüside puhul ei ole soovitud. Varem kasutati kõrge molekulmassiga ühendite spektromeetriliseks uurimiseks kiirete aatomitega pommitamist (fast atom bombardment, FAB) või keemilist derivatiseerimist. Need meetodid on ajamahukad, vähem efektiivsed ning kiirete aatomitega pommitamine on lisaks ka suuremahuliseks kasutamiseks liiga kallis.[3]
MALDI töötasid välja Franz Hillenkamp ja Michael Karas, kes oma esimese töö MALDI alal avaldasid aastal 1985. Nad leidsid, et alaniini massispektri saamiseks trüptofaaniga segus vajati oluliselt väiksemat laseri võimsust kui puhta alaniini korral. Antud maatriksi abil ioniseeriti peptiide massiga kuni 2843 Da (melittiin).[4][5] 1987. aastal avaldas Koichi Tanaka mitmete valkude MALDI-spektrid, näiteks karboksüpeptidaas-A (34 472 Da), kümotrüpsinogeen (25 717 Da) ja tsütokroom c (12 384 Da). Ta kasutas maatriksina koobalti nanoosakesi glütseroolis ja lämmastiklaserit (337 nm).[6]
1988. aastal avaldasid Karas ja Hillenkamp nelja valgu MALDI-spektrid (suurim neist oli veise albumiin, 67 kDa), nad kasutasid maatriksina nikotiinhapet ja Nd:YAG-laserit (266 nm).[7]
Tanaka avaldas samal aastal MALDI-spektrid valkudest molekulmassiga kuni 100 kDa.[6]
2002. aastal anti Koichi Tanakale (nelja vahel jagatud) Nobeli keemiaauhind tema panuse eest valkude massispektromeetriliste uurimismeetodite arendusse.[8]
MALDI kui ionisatsioonitehnika on kombineeritav mitmesuguste massispektromeetria instrumentidega. Esimesena tulid turule MALDI seadmed lennuaja massispektromeetritega (TOF-MS), kus laser oli paigutatud aksiaalselt. Hiljem leiti, et ortogonaalne paigutus vähendab proovi ebaühtluse mõju ning parandab tulemuste täpsust. Tänapäeval on MALDI instrumentide valik lai ning neid on võimalik kasutada koos sisuliselt kõigi erinevate massispektromeetrialiikide instrumentidega. Peptiidide massianalüüsiks kasutatakse peamiselt lennuaja- ja kvadrupoolmassispektromeetreid, suuremat täpsust ja massilahutust vajavate rakenduste, näiteks gaasifaasiliste aluselisuste ja happelisuste) mõõtmiseks on kasutusel MALDI/FT-ICR-instrumendid.[3]
UV-MALDI puhul kasutatakse enamasti lämmastiklaserit (337 nm) ja Nd:YAG-laserit (355 nm ja 266 nm). Kuigi algselt kasutati neljakordistatud sagedusega Nd:YAG-lasereid (266 nm), siis enamasti on uurimistöödes kasutatud lämmastiklasereid, sest need on odavamad, efektiivsemad ja väiksemad. Suure töömahuga aparatuuride puhul sobib aga Nd:YAG-laser paremini. Nd:YAG-laser võimaldab üle 1000, lämmastiklaser vaid kuni 50 impulssi sekundis. Nd:YAG-laseri eluiga on samuti oluliselt pikem, ulatudes miljarditesse impulssidesse, samal ajal kui lämmastiklaserite eluiga jääb vahemikku 20–60 miljonit lasku.[9]
IR-MALDI ei ole niivõrd populaarne, kuid sellel on omad eelised UV-MALDI ees. Infrapunakiirgus on madalama energiaga, seetõttu võimaldab pehmemat ionisatsiooni ja väiksemat fotokeemiliste reaktsioonide saaduste hulka. IR-MALDI tundlikkus on väiksem, ta annab rohkem mitmelaengulisi ioone ja eemaldab lasu kohta rohkem proovi. UV-laseri kiirguse saab muundada infrapunakiirguseks, kasutades optilist parameetrilist ostsillaatorit. Kasutatakse ka mitut liiki infrapunalasereid, näiteks Er:YAG-, TEA-CO2-laser jt.[1]
Maatriksiks sobivatel ainetel on järgmised omadused:
Sobiva maatriksi valik tehakse tihti katse-eksituse meetodil või tuginedes varasematele andmetele.
Peamiselt kasutatakse happelisi maatrikseid, nagu näiteks 2,5-dihüdroksübensoehapet (DHB), α-tsüano-4-hüdroksükaneelhapet ja sinephapet (3,5-dimetoksü-4-hüdroksokaneelhape). Kasutust leiavad ka mõningad pikoliinhappe ning teised kaneelhappe derivaadid. Maatriksile lisatakse sobiv kogus uuritavat ainet ning saadud segu lahustatakse. Tavaliselt kasutatakse lahustina vee ja mõne orgaanilise solvendi, näiteks atsetonitriil, segu.[10]
Maatriksi ja analüüdi lahus kantakse MALDI-plaadile (spetsiaalselt disainitud metallplaat) laikudena. MALDI-analüüsid toimuvad kõrgvaakumis. Lahusega kaetud plaadilt solvendid aurustuvad, jättes plaadile uuritava aine ja maatriksi kristallilise segu. Eesmärgiks on saada võimalikult paks kiht peeneid kristalle, maatriks ja uuritav aine peavad olema jaotunud võimalikult ühtlaselt.
Analüüdi-maatriksi vahekord võib varieeruda laigu ulatuses olulisel määral, sest nende lahustuvused solventides on erinevad. Laigu kuivamine toimub äärtelt keskele. Seega komponendid, mis hakkavad solvendi aurustumisel varem kristalliseeruma, jäävad rohkem laigu äärtele ning vähem keskele. Nii võivad laseriimpulsside tekitatud ioonpaketid oluliselt üksteisest erineda, põhjustades ka erinevaid tulemusi. Sisestandardiga kalibreerimine on raskendatud, sest kergemini ioniseeruvad molekulid kipuvad tagasi tõrjuma raskemini ioniseeruvate ainete ionisatsiooni.[11]
Kuna MALDI peamised rakendused on seotud suure molekulmassiga molekulide analüüsidega, on vaja ka vastavate molekulmassidega kalibrante, mis peaksid olema võimalikult robustsed ja kasutajasõbralikud. Tavalised kalibrandid on valmistatud erinevatest valkudest ja peptiididest, nende puhastamine on aga kallis ning tihti on nende stabiilsus tavatingimustel kehv. Seetõttu on välja töötatud mitmed kalibreerimiskomplekte, mis sisaldavad diskreetse massiga sünteetilisi molekule (näiteks SpheriCal).[12]
MALDI/TOF-massispektromeetrite üks olulisemaid rakendusi on peptiidide sõrmejäljed molekulmassi alusel (peptide mass fingerprinting, PMF). Erinevate aminohappejärjestusega peptiidide massid ("sõrmejäljed") on andmebaasides täpselt määratud. Uuritavate peptiidide analüüsil saadakse spekter, mille massi täpsel määramisel on võimalik vastava andmebaasi olemasolul omistada peptiidile kindel aminohappeline koostis. Sel moel on võimalik tuvastada üle 90% valkudest. MALDI/TOF-TOF abil on võimalik määrata peptiidi aminohappelist järjestust. Selleks uuritakse eellasioonide lagunemist vahetult pärast ioonallikast lahkumist (post-source decay, PSD). Vajadusel kasutatakse fragmentatsiooni esile kutsumiseks ioonide kiirendamist elektriväljas. Ioonide põrkumisel inertgaasi molekulidega toimub sidemete lõhkumine ja ioonide fragmentatsioon (collision-induced dissociation, CID).[13]
MALDI/TOF-spektromeetri abil on võimalik kiirelt ja usaldusväärselt analüüsida madala polüdisperssuse indeksiga (kuni 1,1) polümeeride mass- ning arvkeskmistatud molekulmasse, polüdisperssust ja määrata polümeermolekulide otsmisi rühmi. Kõrgema polüdisperssuse indeksiga polümeeride jaoks kasutatakse lisaks suuruseralduskromatograafiat (size-exclusion chromatography, SEC). Nii ioniseeritakse ühel ajahetkel sarnase molekulmassiga molekulid ning tagatakse ka SEC-kolonni kalibratsioon massi järgi.[14]
Pikka aega tuvastati baktereid fenotüüpide alusel või geenijärjestuste määramise abil. Aastal 1996 leiti, et MALDI/TOF-süsteemi abil on võimalik bakterirakkudest saada spektreid, mida võib käsitleda kui bakteriliigi sõrmejälge. Analüüsi läbiviimiseks vajaliku ettevalmistuse tagavad üldjuhul tavalised MALDI-proovi ettevalmistuse protseduurid. Sarnaselt võib spektreid saada ka seentest ja viirustest. Bakteriliikide spektritele või individuaalsete biomarkerite massidele otsitakse vasteid vastavatest andmebaasidest.[15]
MALDI/TOF-spektritel on veel muid kitsamaid rakendusi meditsiinis ja teistes valdkondades. MALDI/FT-ICR leiab kasutust näiteks tasakaaluliste gaasifaasiliste aluselisuste ja happelisuste uurimisel.[16][17]
Seamless Wikipedia browsing. On steroids.
Every time you click a link to Wikipedia, Wiktionary or Wikiquote in your browser's search results, it will show the modern Wikiwand interface.
Wikiwand extension is a five stars, simple, with minimum permission required to keep your browsing private, safe and transparent.