Πρωτεϊνουρία

Πρωτεϊνουρία ή λευκωματουρία ονομάζεται η παρουσία πρωτεΐνης (λευκώματος) στα ούρα. Ο προσδιορισμός της πρωτεΐνης είναι μια από τις βιοχημικές παραμέτρους της γενικής εξέτασης ούρων. Κλινική πρωτεϊνουρία ορίζεται η απέκκριση πρωτεΐνης που ξεπερνά τα 150 mg/dl ανά 24ωρο. Κατά κανόνα η πρωτεΐνη αυτή προέρχεται από την περιοχή του νεφρού και συγκεκριμένα από τους νεφρώνες. Το 50% των πρωτεϊνών που καταλήγει στα ούρα, κυρίως σε παθολογικές καταστάσεις, προέρχεται από το πλάσμα του αίματος. Συνίσταται δηλαδή από πρωτεΐνες, οι οποίες έχουν υποστεί διήθηση στο αγγειώδες σπείραμα (glomerulus) και έχουν διαφύγει από την επαναρρόφηση στο εγγύς εσπειραμένο σωληνάριο (proximal tubule). Επειδή δε η αλβουμίνη αποτελεί την αφθονώτερη πρωτεΐνη στο πλάσμα, είναι λογικό να κυριαρχεί η παρουσία της και στα ούρα. Πρωτεΐνες εκκρίνονται όμως και από περιοχές των νεφρώνα μακρυά από το αγγειώδες σπείραμα. Τέτοια είναι η πρωτεΐνη Tamm-Horsfall, εκκριτικό προϊόν των κυττάρων του άπω εσπειραμένου σωληναρίου (distal tubule cells).

Σύσταση πρωτεΐνης ούρων

Οι πρωτεΐνες του πλάσματος διηθούνται στο αγγειώδες σπείραμα ανάλογα με το μέγεθός και το φορτίο τους. Οι μικρές πρωτεΐνες κάτω των 20 KDa διηθούνται ελεύθερα, στη συνέχεια αναρροφώνται και αποδομούνται στο εγγύς σωληνάριο. Αυτή η διαδικασία καταβολίζει ορμόνες, όπως η ινσουλίνη και μικρά ανοσολογικά μόρια, όπως οι ελαφρές αλυσίδες των ανοσοσφαιρινών. Οι πρωτεΐνες με μοριακό βάρος μεταξύ 20 kDa και 60 KDa διέρχονται διαμέσου του αγγειώδους σπειράματος μόνο εάν έχουν ευνοϊκό ηλεκτρικό φορτίο δηλαδή αρνητικό φορτίο έτσι ώστε να έλκονται από το θετικό φορτίο των πόρων του αγγειώδους σπειράματος. Οι μεγάλες πρωτεΐνες, άνω των 60 KDa όπως η λευκωματίνη, η τρανσφερίνη και η IgG δε διηθούνται φυσιολογικά και ούτε χάνονται στα ούρα. Μικρή ποσότητα πρωτεϊνών, συνήθως μικρότερη των 100 mg/dl, εκκρίνεται φυσιολογικά στα ούρα υγιών ατόμων καθημερινά.

Κλινική σημασία πρωτεϊνουρίας

Τέσσερις είναι οι κύριες αιτίες που προκαλούν πρωτεϊνουρία δηλαδή αύξηση της ποσότητας της πρωτεΐνης στα ούρα άνω των 150 mg/dl ανά 24ωρο.

Η παρουσία τραύματος στο αγγειώδες σπείραμα

Τέτοια τραύματα φθείρουν τον φυσιολογικό φραγμό που επιβάλλεται στις πρωτεΐνες από τα τοιχώματα των τριχοειδών αγγείων του αγγειώδους σπειράματος, γεγονός που προκαλεί την αύξηση της διαπερατότητας του αγγειώδους σπειράματος σε πρωτεΐνες μεγάλου μοριακού βάρους. Έτσι, η πρωτεϊνουρία από τα φυσιολογικά επίπεδα αυξάνεται σε παθολογικά και η αλβουμίνη και άλλων ειδών πρωτεΐνες του πλάσματος ανέρχονται σε τιμές μεγαλύτερες του 90% των εκκρινόμενων πρωτεϊνών.

Βλάβη στα κύτταρα του εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου

Η κατάσταση αυτή ονομάζεται «σωληναριακή πρωτεϊνουρία» και προκαλεί την μείωση της επαναρρόφησης των πρωτεϊνών από το εγγύς εσπειραμένο σωληνάριο που έχουν διηθηθεί από το αγγειώδες σπείραμα.

Φλεγμονή της ουροποιητικής οδού

Σε αυτή την περίπτωση η αυξημένη κυκλοφορία πρωτεϊνών προέρχεται είτε από φλεγμονώδη ουροεπιθηλιακά κύτταρα είτε από τοπική εξαγγείωση των πρωτεϊνών του ορού στην περίπτωση που η φλεγμονή είναι αιμορραγικής φύσεως.

Αύξηση των πρωτεϊνών

Αυτή προέρχεται από πρωτεΐνες που παράγονται από κακοήθη Β-λεμφοκύτταρα ή πολυμορφοπύρηνα λευκά αιμοσφαίρια. Τα απεκκρινόμενα πρωτεϊνικά παράγωγα των προαναφερόμενων κυττάρων διηθούνται από το αγγειώδες σπείραμα χάρη στο μικρό τους μέγεθος, παρά την ύπαρξη των τοιχωμάτων του αγγειώδους σπειράματος.

Πρωτεϊνουρία και κύηση

Προδιαθεσικός παράγοντας για την παρουσία πρωτεϊνουρίας είναι η κύηση. Π.χ. κατά την προεκλαμψία μπορεί να δημιουργηθεί από παθολογική ενδοθηλιακή λειτουργία και διαταραχή στη σύνθεση των προσταγλαδινών που εκλύονται λόγω της παρουσίας του εμβρύου οίδημα, υπέρταση και πρωτεϊνουρία. Αν η απώλεια πρωτεϊνών είναι μεγάλη, μπορεί να προκύψει νεφρωσικό σύνδρομο κατά τη διάρκεια της κυήσεως, γι' αυτό και οι έγκυες αυτές οφείλουν να παρακολουθούνται.

Παθολογικές καταστάσεις με σύμπτωμα την πρωτεϊνουρία

Αυξημένη πρωτεϊνουρία (μεγαλύτερη από 3-4 g/24h)

• Νεφρωσικό Σύνδρομο
• Αμυλοείδωση
• Ερυθηματώδης Λύκος
• Μεγάλη φλεβική υπεραιμία του νεφρού
• Οξεία και χρόνια σπειραματονεφρίτιδα

Μέτρια πρωτεϊνουρία (1-3 ή 4 g/24h)

• Κοιλιακοί όγκοι και εντερική απόφραξη
• Οξείες λοιμώδεις παθήσεις που προκαλούνται από την ερεθιστική δράση μικροβιακών τοξινών.
• Καρδιακή νόσος
• Βλάβες του κεντρικού νευρικού συστήματος
• Φάρμακα: λ.χ. η ασπιρίνη, τα βαρβιτουρικά, τα κορτικοστεροειδή, η γενταμικίνη, ο χρυσός, η στρεπτομυκίνη κ.ά.
• Νοσήματα του αίματος (πορφύρα, αναιμία, λευχαιμία)
• Ηπατική νόσος με ίκτερο και ασκίτη
• Υπερθυρεοειδισμός
• Ερεθισμός των νεφρών από ακτινοβολία
• Πολλαπλό μυέλωμα
• Νεφροσκλήρωση
• Πυελονεφρίτιδα με υπέρταση
• Σηψαιμία
• Υποξεία μικροβιακή ενδοκαρδίτιδα
• Τοξιναιμία της κύησης
• Τοξικός ερεθισμός του νεφρού από πρόσληψη ουσιών όπως ο υδράργυρος, ο μόλυβδος κ.λπ.

Εμφάνιση μικρού βαθμού πρωτεϊνουρίας (μικρότερη από 1 g/24h)

• Χρόνια πυελονεφρίτιδα
• Πολυκυστική νόσος
• Νεφρική σωληναριακή πάθηση
• Νεφροσκλήρωση
• Χρόνια διάμεση νεφρίτιδα
• Καλοήθης ορθοστατική πρωτεϊνουρία
• Παροδική πρωτεϊνουρία

Παροδική πρωτεϊνουρία

• Αφυδάτωση
• Stress μετά από συγκίνηση
• Έκθεση στο ψύχος
• Πυρετός
• Μετά από αιμορραγία
• Μετά από ένεση αδρεναλίνης
• Διατροφή πλούσια σε πρωτεΐνες
• Ορθοστατική πρωτεϊνουρία
• Νεφρίτιδα από υποκαλιαιμία
• Έντονη και εξαντλητική μυϊκή κόπωση

Ψευδής πρωτεϊνουρία

Η ψευδής πρωτεϊνουρία μπορεί να προκληθεί εξαιτίας της ανάμιξης ούρων με πρωτεϊνούχες ουσίες, όπως στην περίπτωση του αίματος, του πύου και των κολπικών εκκριμάτων. Μπορεί η συγκεκριμένη επιμόλυνση να εμφανιστεί σε περιπτώσεις κυστίτιδας, χρόνιας κολπίτιδας, προστατίτιδας, κατά τη διάρκεια της έμμηνης ρύσης και της πυελίτιδας.

Μικρολευκωματινουρία

Η εμφάνιση αλβουμίνης (ή λευκωματίνης) στα ούρα αποτελεί μη φυσιολογικό φαινόμενο ακόμη και όταν τα ποσά είναι ελάχιστα, εκτός από την περίπτωση υγιών ατόμων που παρουσιάζουν μικρολευκωματινουρία μετά από εντατική άσκηση. Η μέτρηση της μικροαλβουμίνης στα ούρα (με ανοσοχημικές μεθόδους) θεωρείται κριτήριο για την διάγνωση του σακχαρώδους διαβήτη και την πρώιμη ανακάλυψη διαβητικών επιπλοκών στα νεφρά και τα αγγεία.

Υπερβολική πρωτεϊνουρία

Παρουσιάζεται σε περιπτώσεις απώλειας αιμοσφαιρίνης, μυοσφαιρίνης και ανοσοσφαιρίνης στα ούρα. Η μυοσφαιρίνη είναι τοξική και δημιουργεί φαινόμενα οξεία σωληναριακής νέκρωσης. Αντίθετα, η αιμοσφαιρίνη παρουσιάζει τοξικότητα μόνο σε ασθενείς που πάσχουν από αφυδάτωση. Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεΐνης ούρων

Ταξινόμηση πρωτεινουρίας

Η διάγνωση της πρωτεινουρίας απαιτεί τον ποσοτικό προσδιορισμό της αποβαλλόμενης πρωτεΐνης είτε σε συλλογή ούρων 24ώρου είτε με τον υπολογισμό του λόγου πρωτεΐνη/κρεατινίνη ούρων ή αλβουμίνη/κρεατινίνη ούρων σε τυχαίο δείγμα ούρων. Η εξέταση αυτή προτιμάται λόγω της ευκολίας της. Οι τιμές είναι:

Ποσό λευκώματος (mg/dl)	Χαρακτηρισμός
< 30 mg	Φυσιολογική απέκκριση
30 - 150 mg	Μικροαλβουμινουρία
150 - 500 mg/gr	Ήπια αλβουμινουρία
500 - 1000 mg/gr	Μέτρια αλβουμινουρία
1000 - 3000 mg/gr	Βαριά αλβουμινουρία
> 3000 mg/gr	Νεφρωσικού τύπου

Η συλλογή ούρων 24ώρου προτιμάται σε περιπτώσεις εγκυμοσύνης λόγω των μεγάλων διακυμάνσεων στο ποσό της αποβαλλόμενης πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της ημέρας.

Παθολογικές πρωτεΐνες στα ούρα

Τέτοιες είναι λ.χ. οι πρωτεΐνες Bence-Jones. Εμφανίζονται σε ασθένειες, όπως το πολλαπλούν μυέλωμα, η μακροσφαιριναιμία, τα κακοήθη λεμφώματα, η αμυλοείδωση και στους μεταστατικούς όγκους των οστών. Ανιχνεύονται με ηλεκτροφόρηση και ανοσοκαθήλωση.

Συλλογή δείγματος ούρων

Ο ποιοτικός και ημιποσοτικός προσδιορισμός της πρωτείνης στα ούρα γίνεται σε πρωινά ούρα μέσης ούρησης. Ο ποσοτικός προσδιορισμός γίνεται σε ούρα 24ώρου.

Τιμές αναφοράς

Στα πρώτα πρωινά ούρα τιμές πρωτείνης μέχρι 30 mg/dl θεωρούνται φυσιολογικές. Αυτή η τιμή χαρακτηρίζεται ως ίχνη. Ίχνη πρωτείνης είναι συνηθισμένα σε ηλικιωμένους ανθρώπους.

Μέθοδοι υπολογισμού της πρωτεϊνουρίας

Το λεύκωμα, αρχικά, μετράται σε δείγμα των πρώτων πρωινών ούρων. Αν μετρηθεί μεγαλύτερη ποσότητα του φυσιολογικού, επιβάλλεται ο προσδιορισμός της πρωτεϊνουρίας να πραγματοποιηθεί σε ούρα 24ώρου.
Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι υπολογισμού ή ανίχνευσης των πρωτεϊνών στα ούρα. Χαρακτηρίζονται ως ποιοτικές, ημιποσοτικές και ποσοτικές. Στις περισσότερες από αυτές θα πρέπει τα ούρα να είναι διαυγή, πράγμα που επιτυγχάνεται με τη σωστή συλλογή και συντήρησή τους. Σε διαφορετική περίπτωση πρέπει το δείγμα να φυγοκεντρηθεί. Επιπλέον το pH των ούρων θα πρέπει να είναι όξινο.

Ποιοτικές Μέθοδοι

Μέθοδος θέρμανσης με Οξικό Οξύ

Πρόκειται για ποιοτική μέθοδο υπολογισμού των λευκωμάτων με όριο ανίχνευσης 5-10 mg/dl. Στηρίζεται στην αρχή πήξεως της λευκωματίνης και των σφαιρινών με θέρμανσή τους σε pH = 4,0 - 5. Παρουσίας ανόργανου άλατος (η χρήση του οξικού οξέος εναπόκειται στην επίτευξη του σωστού pH) τα ούρα θερμαίνονται και εμφανίζουν θολερότητα, κροκίδες ή ίζημα παρουσία πρωτεϊνών.
Τεχνική

1. Γεμίζουμε δύο σωληνάρια των 5 ml με ούρα. Τα ούρα πρέπει να είναι διαυγή. Αν δεν είναι διαυγή διαυγάζονται.
2. Βράζουμε το ένα δείγμα πάνω σε φλόγα.
3. Αν παρουσιαστεί θολερότητα προσθέτουμε 3 σταγόνες πυκνού οξικού οξέος (ή αραιού 30% από 5 - 10 σταγόνες). Αν η θολερότητα οφείλεται στην παρουσία λευκώματος, δεν διαλύεται με την παρουσία οξέος αλλά αντίθετα εντείνεται.
4. Για να εκτιμήσουμε την θολερότητα συγκρίνουμε το σωληνάριο που έχει βραστεί και οξινιστεί με το δεύτερο σωληνάριο των ούρων που έμεινε ανέγγιχτο.
   

Η αναγραφή των αποτελεσμάτων βασίζεται στον παρακάτω πίνακα:

Ποσό λευκώματος (mg/dl)	Χαρακτηρισμός	Θολερότητα
5	Αρνητικό
10	(±) Ίχνη ελάχιστα	Μόλις διακρίνεται
50	(+) Ίχνη	Φανερή. Διακρίνονται γράμματα διαμέσου αυτής
200	(++) Μετρητό λίγο	Έντονη με αιωρούμενα κοκκία
> 500	(+++) Μετρητό	Έντονη με κροκίδες και ίζημα

Μέθοδος Σουλφοσαλικυλικού Οξέος (Θειοσαλικυλικού οξέος)

Θετικό αποτέλεσμα δοκιμασίας σουλφοσαλυκυλικού οξέος για το προσδιορισμό λευκώματος στα ούρα

Το θειοσαλικυλικό οξύ προκαλεί την καθίζηση του λευκώματος λόγω αλλαγής του ηλεκτρικού φορτίου των πρωτεϊνών και δημιουργίας συμπλόκων.
Τεχνική

1. Φυγοκεντρούνται 12 ml ούρων.
2. Μεταγγίζονται 11 ml ούρων από το υπερκείμενο σε σωληνάριο πωματιζόμενο.
3. Προσθέτονται στο σωληνάριο 2 ml θεοσαλικυλικό οξύ 7%.
4. Ανακίνηση.
5. Σε 10 λεπτά ολοκληρώνεται η αντίδραση.
   

Η μορφή αναγραφής των αποτελεσμάτων βασίζεται στον παρακάτω πίνακα:

Χαρακτηρισμός	Εμφάνιση	Ποσότητα λευκώματος (mg/dl)
Αρνητική	Διαυγής	< 5
Ίχνη	Ελαφρά θολή	5 - 20
(+)	Θολή χωρίς κοκκίωση	20 - 100
(++)	Θολή με κοκκίωση χωρίς κροκίδες	100 - 300
(+++)	Θολή με κοκκίωση και αρχόμενη κροκίδωση	300 - 500
(++++)	Μάζες από κροκίδες που πέφτουν στον πυθμένα	> 500

Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου είναι 5-10 mg/dl. Η μέθοδος έχει μεγάλη ευαισθησία στην ανίχνευση λευκωματίνης, σφαιρινών, γλυκοπρωτεϊνών και των πρωτεϊνών Bence-Jones.

Ημιποσοτικές μέθοδοι

Προσδιορισμός πρωτείνης με ταινία ούρων

Ταινίες ούρων (urine strips)

Αποτελούν την πιο απλή και εύχρηστη χρωματομετρική μέθοδο. Παρόλα αυτά παρουσιάζουν μειωμένη ευαισθησία, καθώς δεν μπορούν να ανιχνεύσουν σφαιρίνες, πρωτεϊνες Bence-Jones και μουκοπρωτεϊνες. Ανιχνεύουν ποσότητες από 5-20 mg λευκωματίνης/dl ούρων. Η μέθοδος βασίζεται στην αντίδραση του πρωτεϊνικού σφάλματος, δηλαδή το σφάλμα που προκαλεί η παρουσία των πρωτεϊνών σε ένα δείκτη pH. Συγκεκριμένα οι πρωτεΐνες, οι οποίες διαθέτουν θετικά και αρνητικά φορτία, αντιδρούν με τον δείκτη pH κυανού της τετραβρωμοφαινόλης σε όξινο περιβάλλον μεταβάλλοντας το χρώμα του από κίτρινο μέχρι πράσινο.

Αυτόματοι Αναλυτές Ούρων

Υπάρχουν δύο κύρια είδη αναλυτών: οι αναλυτές που αναγνώσουν ταινίες ούρων και αυτοί που επιδέχονται άμεσο μη φυγοκεντρημένο δείγμα ούρων. Η τεχνολογία στην οποία βασίζεται η ανάγνωση των ταινιών αλλά και των αναλυτών μη φυγοκεντρημένου δείγματος είναι η ανακλασιμετρία.

Ηλεκτροφόρηση Λευκωμάτων

Όταν η ποσότητα των πρωτεϊνών των ούρων είναι μεγαλύτερη από 1,5 g/dL,

συστήνεται η ηλεκτροφόρηση, έτσι ώστε να έχουμε ακριβώς το ποσοστό κάθε είδους λευκώματος.

Ανίχνευση Λευκώματος Bence-Jones

Η τεχνική ανίχνευσης στηρίζεται στην ιδιότητα που έχει το λεύκωμα Bence-Jones να πήζει σε θερμοκρασία 60^ο C, να διαλύεται σε θερμοκρασία βρασμού και να επανεμφανίζεται στους 40 - 50^ο C. Οι περισσότερες δοκιμασίες για παρουσία πρωτεϊνών στα ούρα δίνουν θετικά αποτελέσματα, όταν οι συγκεκριμένες πρωτεΐνες υπάρχουν σε μεγάλα ποσά στα ούρα. Η πιο κατάλληλη μέθοδος για την ανίχνευσή του είναι η ανοσοκαθήλωση.

Ποσοτικές Μέθοδοι

Μέθοδος Esbach

Το αντιδραστήριο Esbach περιέχει πικρικό οξύ, το οποίο προκαλεί καθίζηση των πρωτεϊνών που βρίσκονται στα ούρα. Απαιτεί ούρα χαμηλού ειδικού βάρους, που αραιώνονται στην περίπτωση που διαθέτουν υψηλό ειδικό βάρος. Η εξέταση πραγματοποιείται σε φυγοκεντρημένα και όξινα ούρα 24ώρου, μέσω του ειδικού λευκωματομέτρου Esbach, το οποίο είναι ένας ειδικός σωλήνας που φέρει υποδιαιρέσεις από το 0,5 -12 gr λευκώματος/L ούρων. Φέρει ακόμη δύο χαραγές με τις ενδείξεις U [Urine], R [Reagent]. Συνοδεύεται από ελαστικό πώμα και ειδική ξύλινη θήκη όπου φυλάσσεται για 24 ώρες σε κατακόρυφη θέση αφού τοποθετηθεί το δείγμα και το αντιδραστήριο σε αυτό.

Μέθοδος Aufrecht

Αποτελεί παραλλαγή της μεθόδου Esbach αφού χρησιμοποιεί επίσης πικρικό οξύ. Παρουσιάζει όμως το πλεονεκτήματα της δυνατότητας απόδοσης αποτελεσμάτων σε σύντομο χρονικό διάστημα και την αποφυγή αραίωσης ούρων που διαθέτουν υψηλό ειδικό βάρος. Η μονάδα μέτρησης που χρησιμοποιεί είναι gr λευκώματος/dL ούρων.

Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτείνης στα ούρα με την μέθοδο Aufrecht

Φωτομετρικές Μέθοδοι

Συνήθη μέθοδο αποτελεί εκείνη του σουλφοσαλικυλικού οξέος. Απαιτούνται ούρα 24ώρου μη φυγοκεντρημένα. Το αποτέλεσμα εκφράζεται ως mg λευκώματος/dL ούρων.

Μέθοδοι Προσδιορισμού της Μικρολευκωματινουρίας

Ελάχιστα ποσά πρωτεϊνών, όπως η β2-μικροσφαιρίνη, προσδιορίζονται με ανοσοχημικές μεθόδους, στις οποίες γίνεται χρήση αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών. Τέτοιες είναι η νεφελομετρία και η ραδιοανοσολογική ανάλυση.

Βιβλιογραφία

1. Ιωαννίδης Ι. Κλινική Χημεία Ι: Ανάλυση Ούρων: Θεωρία. Εκδόσεις Γιαχούδη. Θεσσαλονίκη, 2004.
2. Ιωαννίδης Ι. Κλινική Χημεία Ι: Ανάλυση Ούρων: Εργαστήριο. Εκδόσεις Γιαχούδη. Θεσσαλονίκη, 2002.
3. Μελέκος Μ. Σύγχρονη Ουρολογία. Ιατρικές εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης 2006.
4. Καλινδέρης Α. Γενική Ουρολογία. Εκδόσεις Σιώκης 1999.
5. Καρκαλούσος Π. Η χημεία των ταχυδιαγνωστικών ταινιών ούρων. Έκδοση ΤΕΙ Αθηνών, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων 2008.
6. Jamison R, Wilkinson R. Textbook of Nephrology. Chapman and Hall (Medical Publishers) 1997.