Middlesboro, auch Middlesborough, ist eine Stadt im Bell County des Bundesstaates Kentucky in den Vereinigten Staaten. Das U.S. Census Bureau hat bei der Volkszählung 2020 eine Einwohnerzahl von 9.405 ermittelt. Sie liegt westlich der Cumberland Gap und ist die größte Stadt im südöstlichen Kentucky. Sie befindet sich vollständig zwischen Pine Mountain und den Cumberland Mountains im Middlesboro Basin, einem riesigen Meteoritenkrater. Die Stadt behauptet, die einzige in den Vereinigten Staaten zu sein, die komplett innerhalb eines solchen Kraters gebaut wurde, sowie die Heimat der Ragtime-Musik und des ältesten kontinuierlich bespielte Golfplatz des Landes zu sein.