From Wikipedia, the free encyclopedia
U molekulskom kloniranju, vektor je svaka čestica (npr. plazmidi, kozmidi, lambda fagi) koja se koristi kao sredstvo za vještački unos stranu nukleinske sekvence – obično DNK – u drugu ćeliju, gdje se može replicirati i/ili eksprimirati.[1] Vektor koji sadrži stranu DNK naziva se rekombinantna DNK. Četiri glavna tipa vektora su plazmidi, virusni vektori, kozmidi, i vještački hromosomi. Od njih, najčešće korišćeni vektori su plazmidi.[2] Zajedničko svim projektovanim vektorima je da imaju porijeklo replikacije, mjesto višestrukog kloniranja i marker koji se može birati.
Sam vektor općenito nosi sekvencu DNK koja se sastoji od inserta (u ovom slučaju transgena) i veće sekvence koja služi kao "kičmmeni" vektor. Svrha vektora koji prenosi genetičke informacije u drugu ćeliju je tipično da izoluje, umnožava ili eksprimira insert u ciljnoj ćeliji. Svi vektori se mogu koristiti za kloniranje i stoga su vektor za kloniranje, ali postoje i vektori dizajnirani posebno za kloniranje, dok drugi mogu biti dizajnirani posebno za druge svrhe, kao što su transkripcija i ekspresija proteina. Vektori dizajnirani posebno za ekspresiju transgena u ciljnoj ćeliji nazivaju se ekspresijski vektor i općenito imaju promotorsku sekvencu koja pokreće ekspresiju transgena. Jednostavniji vektori koji se nazivaju transkripcijski vektori mogu se samo transkribovati, ali ne i prevesti: mogu se replicirati u ciljnoj ćeliji, ali ne i eksprimirati, za razliku od ekspresijskih vektora. Transkripcijski vektori se koriste za amplifikaciju njihovog inserta.
Manipulacija DNK se obično izvodi na E. coli vektora, koji sadrže elemente neophodne za njihovo održavanje u E. coli. Međutim, vektori mogu imati i elemente koji im omogućavaju da se održe u drugom organizmu kao što su ćelije kvasca, biljaka ili sisara, a ovi vektori se nazivaju šatl vektori. Takvi vektori imaju bakterijske ili virusne elemente koji se mogu prenijeti na nebakterijski organizam domaćina, ali razvijeni su i drugi vektori koji se nazivaju intragenski vektori kako bi se izbjegao prijenos bilo kojeg genetičkog materijala sa strane vrste.[3]
Insercija vektora u ciljnu ćeliju obično se naziva transformacija za bakterijske ćelije,[4] transfekcija za eukariotske ćelije,[5] iako se umetanje virusnog vektora često naziva transdukcija.[6]
Plazmidi su dvolančane vanhromosomske i općenito kružne sekvence DNK koje su sposobne za replikaciju pomoću mehanizma za replikaciju ćelije domaćina.[7] Plazmidni vektori minimalistički se sastoje od početka replikacije koji omogućava polunezavisnu replikaciju plazmida u domaćinu. Plazmidi se široko nalaze u mnogim bakterijama, naprimjer u Escherichia coli, ali se mogu naći i u nekoliko eukariota, naprimjer u kvascima, kao npr. u Saccharomyces cerevisiae.[8] Bakterijski plazmidi mogu biti konjugativni/prenosivi i nekonjugativni:
Plazmidi sa posebno konstruisanim karakteristikama se obično koriste u laboratoriji za svrhe kloniranja. Ovi plazmidi općenito nisu konjugativni, ali mogu imati mnogo više karakteristika, posebno "mjesto višestrukog kloniranja", gdje višestruka mjesta cijepanja restrikcijskim enzimom dozvoljavaju umetanje transgenskog inserta. Bakterije koje sadrže plazmide mogu generirati milione kopija vektora unutar bakterija za nekoliko sati, a pojačani vektori se mogu ekstrahirati iz bakterija za dalju manipulaciju. Plazmidi se mogu koristiti posebno kao vektori za transkripciju i takvim plazmidima mogu nedostajati ključne sekvence za ekspresiju proteina. Plazmidi koji se koriste za ekspresiju proteina, zvani ekspresijski vektori, bi uključivali elemente za translaciju proteina, kao što su ribosomsko vezno mjesto, startni i stop kodoni .
Virusni vektori su genetički modifikovani virusi koji nose modifikovanu virusnu DNK ili RNK koja je postala neinfektivna, ali i dalje sadrže virusne promotore, kao i transgen, što omogućava transgenu transgena kroz virusni promotor. Međutim, budući da virusnim vektorima često nedostaju infektivne sekvence, oni zahtijevaju pomoćne viruse ili linije za pakovanje za transfekciju velikih razmjera. Virusni vektori su često dizajnirani za trajnu inkorporaciju inserta u genom domaćina i tako ostavljaju različite genetičke marketre u genomu domaćina nakon ugradnje transgena. Naprimjer, retrovirusi ostavljaju karakterističan obrazac zvani retrovirusna integracija nakon umetanja koji se može detektirati i ukazuje da se virusni vektor ugradio u genom domaćina.
Vještački hromosomi su proizvedeni hromosomi u kontekstu vještačkog kvaščevog hromosoma (YAC), bakterijskog vještakog hromosoma (BAC) ili ljudskog vještačkog hromosoma (HAC). Vještački hromosom može nositi mnogo veći fragment DNK od drugih vektora.[9] YAC i BAC mogu nositi fragment DNK dug do 300.000 nukleotida. Tri strukturne potrebe za vještačkim hromosomom uključuju porijeklo replikacije, centromere i telomerne krajnje sekvence.[10]
Transkripcija kloniranog gena je neophodna komponenta vektora kada je potrebna ekspresija gena: jedan gen se može pojačati transkripcijom, kako bi se stvorile više kopija iRNK, šablona na kojima se protein može proizvesti translacijom.[11] Veći broj iRNK bi eksprimirao veću količinu proteina, a koliko će se kopija iRNK generirati ovisi o promotoru koji se koristi u vektoru.[12] Ekspresija može biti konstitutivna, što znači da se protein konstantno proizvodi u pozadini, ili može biti inducibilna pri čemu se protein eksprimira samo pod određenim uslovima, naprimjer kada se doda hemijski induktor. Ova dva različita tipa ekspresije zavise od tipa promotora i operatora koji se koristi.
Virusni promotori se često koriste za konstitutivnu ekspresiju u plazmidima i virusnim vektorima jer normalno podstiču konstantnu transkripciju u mnogim ćelijskim linijama i tipovima.[13] Inducibilna ekspresija zavisi od promotora koji reaguju na uslove indukcije: naprimer, promotor virusa tumora mišje mliječne žlezde samo pokreće transkripciju nakon primjene deksametazona i promotor toplotnog šoka u rodu "Drosophila" počinje tek nakon visokih temperatura.
Neki vektori su dizajnirani samo za transkripciju, naprimjer za in vitro proizvodnju iRNK. Ovi vektori se nazivaju transkripcijski vektori. Možda im nedostaju sekvence neophodne za poliadenilaciju i terminaciju, stoga se ne mogu koristiti za proizvodnju proteina.
Ekspresijski vektori proizvode proteine kroz transkripciju inserta vektora nakon čega slijedi translacija proizvedene iRNK; stoga im je potrebno više komponenti od jednostavnijih vektora samo za transkripciju. Ekspresija u različitim organizmima domaćinima zahtijevala bi različite elemente, iako dijele slične zahtjeve, naprimjer promotor za inicijaciju transkripcije, ribosomsko vezivno mjesto za inicijaciju translacije i signale terminacije.
Ekspresijski vektori eukariota zahtijevaju sekvence koje kodiraju za:
Moderni umjetno konstruirani vektori sadrže bitne komponente koje se nalaze u svim vektorima, a mogu sadržavati i druge dodatne karakteristike koje se nalaze samo u nekim vektorima:
Seamless Wikipedia browsing. On steroids.
Every time you click a link to Wikipedia, Wiktionary or Wikiquote in your browser's search results, it will show the modern Wikiwand interface.
Wikiwand extension is a five stars, simple, with minimum permission required to keep your browsing private, safe and transparent.